Способ определения активности с @ /м @ -зависимой эндонуклеазы лимфоцитов

 

Изобретение относится к аналитической биохимии, в частности для выявления снижения активности CA/MG-зависимой эндонуклеазы у животных, больных хроническим лимфолейкозом. Целью изобретения является упрощение, а также повышение чувствительности способа. Лимфоциты периферической крови получают пропусканием образцов через колонки с хлопковым волокном и последующим гемолизом. Выделяют клеточные ядра, инкубируют их при рН 8,0-8,3 в течение 3-4 ч в присутствии 10 мМ MGCL<SB POS="POST">2</SB> и 1 мМ CACL<SB POS="POST">2</SB>, экстрагируют ДНК, разделяют электрофорезом в горизонтальных блоках агарозы и активность фермента рассчитывают по изменению пика субстратной ДНК.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (51)5 G Ol N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21 ) 434501 4/30-13 (22) 17.12.87 (46) 07.02.90. Бюл. Р 5 (71) Научно-исследовательский институт медицинской энзимологии АМН СССР и Научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (72) Н.Н. Ходарев, И.В. Чупырина, С.С. Александрова, А.К. Газдаров, Г.Ф, Коромыслов и И.И. Вотрин (53) 616.155.392.2 (088.8) (56) Доклады АН СССР, !983:, т. 268, N- 4, с. 1000-1003. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

Са/Mg-ЗАВИСИМОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗ1! ЛИМФОЦИТОВ

Изобретение относится к аналити.ческой биохимии, в частности для выявлений изменения актиЪности C& Mgзависимой эндонуклеазы при диагностике хронического лимфолейкоза крупного рогатого скота.

Целью изобретения является повьппение чувствительности и упрощение способа.

Способ состоит в выделении лимфоцитов посредством пропускания крови через колонки с хлопковым волокном и последующим гемолизом, выделении клеточных ядер из лимфоцитов, инкубации выделенных клеточных ядер при рН 8,0-8,3 в течение 3-4 ч, экстракции из них ДНК, ее электрофореза в горизонтальных блоках агарозных гелей с двумя параллельными рядами колодцев и определении активности фер„„SU„„1541514 А1

2 (57) Изобретение относится к аналитической биохимии, в частности для выявления снижения активности Са Mgзависимой эндонуклеазы у животных, больных хроническим лимфолейкозом.

Целью изобретения является упрощение, а также повышение чувствительности способа. Лимфоциты периферической крови получают пропусканием образцов через колонки с хлопковым волокном и последующим гемолизом, Выделяют клеточные ядра, инкубируют их при рН 8,08,3 в течение 3-4 ч в присутствии

10 мМ MgClg и 1 мМ С&С1, экстрагируют ДНК, разделяют электрофорезом в горизонтальных блоках агарозы и активность фермента рассчитывают по изменению пика субстратной ДНК.

1 мента по изменению профиля пика субстрактной ДНК, Пример. Стабилизированную кровь, содержащую гепарин (10 ед/мин), в количестве 50 мп от одного животного пропускают через термостатированную колонку по типу прямого холодильника (высота колонки 200 мм, внутренний диаметр 25 мм) с 0,5 г хлопкового волокна марки 9647-И при 37 С.

Элюат, содержащий в основном лимфоциты и эритроциты, подвергают гемо лизу. Для этого к 50 мл элюата на холоде добавляют 150 мл ледяного раствора 0,837 хлористого аммония и через 1-2 мин инкубации на ледяной бане центрифугируют при 400g, 20 мин о при 4 С. Остаток лимфоцитов дважды промывают в 50 мл среды Хенкса. Вы1541514 ход лнмфоцитов в конечном препарате составляет болеp 90Z клеTAK °

Лим 1>оциты гемогенизируют в 10 мл среды ТМС-0,9 (30 ммоль трис-НС1, рН 8,0; 3 ммоль MgCl z, 0,9 моль сахарозы, 0,002_#_-ный тритон Х-100 в количестве 0,002X) в гомогенизаторе

Эвельхейма-Поттеря, Полученный гомогенят Hàñëàèíÿþò на раствор TMC — 1,2 lp (30 ммоль трис-НС1, рН 8,0; 3 ммоль

М1СЭ ; 1,2 моль сяхарозы) в соотноше— нии l:3 и центрифугируют 10 мин, 1500-2000 р при 4 С.

Осадки ядер суспендируют в минимальном объеме ТМС вЂ” 0,9 без тритона

Х-100, затем доводят объем TMC-0,9 до 10-12 мл и суспензию центрифугируют 1500-2000 p при 4 С 10 мин. Осадки по данным световой микроскопии пред- 20 ставляют собой интактные клеточные ядра, свободные от цитоплазматических з ягрязнений, Выход ядер О, 3 мг

ДНК/10 лимфоцитов.

Дпя определения активности Ca/Mp; — 25 зависимой зндонуклеазы клеточные ядра суспендируют в инкубационной среде

ТМСС (50 ммоль трис-НС1, рН 8,3;

10 ммоль МрС1.2, 1 ммоль СаС1;

0,25 моль сяхярозы) до концентрации

1 Mr/ìë по ДНК, В инкубационные пробирки (.Эппендорф) вносят 10-50 мкл суспензии ядер в ТМСС. Инкубацию проводят при 37 С в течение 4 ч на термостатируемом шейкере. По окончании инкубации в каждую пробу вносят рав ный объем 2 М 11яГ1 и 0,1 объема 10 ного додецилсульфятя натрия, после чего добавляют протеиназу К до конечной .концентрации 100 мкг/мп и инкубируют 30 мин для протеолиза и освобождения ДНК из ДНК вЂ” белковых комплексов, После этого к пробам добавляют равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1) и 45 встряхивают 20 мин на шейкере. Пробы центрифугируют при 3000 р 10-15 мин, переносят водную (верхнюю) фазу, со« держащую ДНК, в чистые микропробирки, после чего к образцам добавляют

1,5 объема 501-ного глицерина, содержащего 2,5% бромфенолового синего.

Для проведения электрофореза ДНК готовят горизонтальные блоки агарозы (27) в стандартном трис-яцетатном буфере. Размер блоков 17 (20-24) см.

В блоках Формируют двя ряда гнезд, для чего вставляют я Форму параллельно друг дру| у ня расстоянии 10 см

"гребенки" с 20-25 зубчиками, в каждый канал вносят пробы, содержащие

5 мкг ДНК. .Электрофорез проводят при напряжении !50 В и максимальном токе в течение одного часа. Гель окрашивают бромистым этидием (1 мкг/мл ) и фотографируют, освещая двумя ультрахемископями с длиной волны 254 нм, расположенными с обеих сторон геля параллельно направлению каналов с углами наклона к поверхности геля 45 .

Полученные негативы сканируют на данситометре "Хромоскан-200". Денситограммы представляют распределение

ДНК, выделенной из клеточных ядер, Пики соответствуют субстратной (хромосомной) ДНК неинкубировянных и инкубированных 3 ч ядер. На высоте

2/3 амплитуды измеряют ширину пика (В) и относят ее к 1/3 амплитуды (Р).

Величину В/Р обозначают как А для неинкубировянных ядер и А для ядер, инкубированных в течение 3 ч. Активность определяют по формуле

А t — Ао

А = --- — — х 100 .

А о

За единицу активности принимают такое количество фермента, которое обеспечивает за 3 ч инкубации клеточных ядер в концентрации 1 мг/мл в среде с 10 ммоль MgC1 1 ммоль ГаС1 при рН 8,0-8,5 изменение величины А на 0,01 по сравнению с интактными (неинкубированными) ядрами.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить активность

СА/Мр,-зависимой эндонуклеазы клеточных ядер лимфоцитов крови. формула изобретения

Способ определения активности

Са Mg-зависимой эндонуклеазы лимфоцитов путем выделения из лимфоцитов клеточных ядер в присутствии сахарозы и тритона Х=100, инкубации ядер в растворах, содержащих 1 мМ СаС1, 10 MM MgCl., экстракции и последующего электрофореза ядерной ДНК в блоках геля агарозы, расчета активности

Ca/Mg-зависимой эндонуклеазы лимфоцитов, отличающийся тем ф что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, ядра инкубируют при рН 8,0-8,3 в течение

3-4 ч, я электрофорез ядерной ДНК проводят в горизонтальных блоках гелей агарозы,