Штамм культивируемых перевиваемых клеток кожно-мышечной ткани эмбриона кролика, используемый для выделения и накопления вирусов

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой новый штамм перевиваемых клеток кожно-мышечной ткани эмбриона кролика, используемый для культивирования вирусов. Штамм хранится под номером ВСКК(СХЖ) N25. Культура состоит из эпителиоподобных клеток полигональной формы с четко выраженными границами. Ядра округлые, различной величины и формы. Ядрышки крупные, от 1 до нескольких в ядре. Цитоплазма мелкосетчатая. Клетки имеют околотетраплоидный набор хромосом, есть высокоплоидные клетки. Имеются 3-4 микрохромосомы различной формы и непарная длинная субметацентрическая маркерная хромосома. Модальный класс 89 хромосом. При посевной концентрации 50 тыс.клеток на 1 мл среды сплошной монослой образуется на 3 сутки. Индекс пролиферации 2-3. Время удвоения популяции 18 ч. Клетки обладают стабильными ростовыми свойствами, способны расти на различных питательных средах, обладают высокой чувствительностью к вирусам парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, реовирусу 3-го типа, вирусам ринопневмонии (три штамма), диареи крупного рогатого скота, а

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 5 С 12 N 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНЯТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4406501/30-13 (22) 06.04.88 (46) 23.02.90. Бюл. В 7 (71) Всесоюзный научно-исследовательский и технологический институт биологической промьш.ленности (72) Н.И.Гвозденко, Л.П.Дьяконов, Г.P.Ìèõàéëîâà, Б.В.Соловьев и H.M.Ïóõîâà (53) 578.085.23(088.8) (54) ШТАММ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПЕРЕБИВАЕМЫХ КЛЕТОК КОЖНО-МЫШЕЧНОЙ ТКАНИ ЭМБРИОНА КРОЛИКА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И НАКОПЛЕНИЯ ВИРУСОВ (57) Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой новый штамм перевиваемых клеток кожно-мышечной ткани эмбриона кролика, используемый для культивирования вирусов. Штамм хранится под номером

ВСКК (СХЖ) 11 25. Культура состоит из эпителиоподобных клеток полигональной

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой новый штамм перевиваемых клеток кожномышечной ткани эмбриона кролика, используемый для выделения и накопления вирусов.

Цель изобретения - получение нового штамма.

Штамм получают следующим образом.

Изолированную кожно-мьппечную ткань

2-недельного эмбриона кролика подвергают дробной трипсинизации по стандартной методике. Полученные клетки

„„SU„„1544797 A 1

2 формы с четко выраженными границами.

Ядра округлые, различной величины и формы. Ядрышки крупные, от 1 до нескольких в ядре. Нитоплазма мелкосетчатая. Клетки имеют околотетраплоидный набор хромосом, есть высокоплоидные клетки. Имеются 3-4 микрохромосомы различной формы и непарная длинная субметацентрическая маркерная хромосома. Модальный класс 89 хромосом. При посевной концентрации

50 тыс. клеток на 1 мл среды сплошной монослой образуется на 3-е сутки. Индекс пролиферации 2-3. Время удвоения популяции 18 ч. Клетки обладают стабильными ростовыми свойствами, способны расти на различных питательных средах, обладают высокой чувствительностью к вирусам парагриппа-3 инфекционного ринотрахеита, реовирусу 3-го типа, вирусам ринопневмонии (три штамма), диареи крупного рогатого скота, артеринта лошадей. высевают в культуральные сосуды, посевная концентрация 3 15 кл/мл. Рос5 товая среда для первично-трипсинизированных клеток — 0,5Х-ный гидролизат лактальбумина на солевом растворе Хенкса (ГЛАХ) с добавлением 102 сыворотки к.р.с. 11онослой клеток формируется на 3-е сут. При субкультивировании этой культуры используют ту же среду, монослой формируется на

2-е сут. На ранних пассажах в культуре преобладают фибробластоподобные клетки. На 12-м пассаже в монослое

1544797

40 заметны первые колонии эпителиоподооных клеток. При съеме клеток смесью растворов трипсина и версена (1:5) от стекла в первую очередь отслаива- 5 ются фибробластоподобные клетки. Их удаляют, а к оставшимся на стекле колониям эпителиоподобных клеток добавляют свежую порцию питательной средЫ, состоящей иэ смеси ГЛАХа и Игла (1:1)10 или только из ГЛАХа с добавлением

5-10Х сыворотки к.р.с. Через 2-3 сут колонии разрастаются, образуя сплошной монослой. В данной культуре 100Хный монослой эпителиоподобных клеток получен на 15-16 пассажах.

Штамм депонирован под номером ВСКК (СХЖ) Ф 25 и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. 20

Клетки хорошо растут на смеси сред ГЛАХа и Игла (1:1), Игла в любой модификации, а также на ГЛАХе и отечественной среде ФМГс с добавлением 5-10Х сыворотки к.р.с. Посевная 25 доза 5 10 — 7 10 кл/мл. Кратность рассева (1:2)-(1:3). Метод снятия с поверхности культурального сосуда:

0,02Х-ный версен и 0,25Х-ный трипсин в соотношении 5:1. Частота пассиро- 30 вания — через 2-3 сут.

Консервация клеток.

Криозащитная среда: ростовая среда

70Х, сыворотка к.р.с. 20Х, ДМСО 10Х.

Выживаемость 70-80Х. Режим замораживания: эквилибрация при 4 С в течение рО

1 ч, далее снижение температуры до

-60 С со скоростью 1 град/мин, затем клетки помещают в жидкий азот на

-196 С.

Морфология клеток.

Культура состоит иэ полиморфных эпителиоподобных клеток. Встречаются гигантские клетки. Ядра округлые, различной величины. Ядрышки крупные, 45 от 1 до нескольких в ядре. Питоплазма мелкосетчатая. Кариология линии на уровне 51 пассажа. Кариотип соответствует виду (2п=44). Модальный класс 88-89 хромосом. Клетки имеют

50 околотетраплоидный кариотип, отличаются большим разбросом числа хромосом. Имеется 3-4 микрохромосомы и непарная длинная субметацентрическая маркерная хромосома.

Контаминанты.

Бактерии, грибы, микоплаэмы и вирусы не обнаружены.

Чувствительность к вирусам.

Линия клеток представляет собой высокопродуктивный субстрат для куль1 ивирования вирусов ринопневмонни (три штамма), артериита лошадей, реовирусу 3-го типа, инфекционного ринотрахеита, диареи крупного рогатого скота, парагриппа-3.

Пример 1. Культивирование вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, штамм ТК-А (ВИЭВ)

В-2, .

Монослой линии перевиваемых клеток

КМЭКр-85 снимают с поверхности матраса следующим образом. Сливают культуральную жидкость, в матрас вносят подогретый до 37 С диспергирующий раствор, состоящий из 0,25Х-ного раствора трипсина и 0,02Х-ного раствора версена (в соотношении 1:5) в количестве 60-80 мл. Укаэанным раствором обводят несколько раэ клеточный пласт и оставляют матрас на 2-3 мин при комнатной температуре. После этого небольшая часть клеток начинает отделяться от стекла, матрас осторожно переворачивают так, что клеточный пласт находится наверху. Основную часть этого раствора сливают. Отслоившиеся клетки ресуспендируют в питательной среде: в 0,5Х-ном гидролизате .пактальбумина с последующим добавлением 5-10Х сыворотки к.р.с. Урожай клеток после 3-суточного культивирования с одного матраса составляет 50-60 млн. клеток. Полученные концентрированные суспензии клеток разводят соответствующими питательными средами до концентрации 50-100 тыс.кл/мл и высевают в 1,5 л матрасы. Через сутки ростовую среду сливают, культуру промывают средой без сыворотки и вносят вируссодержащую суспензию из расчета О, 1 вируссодержашая частица на 1 клетку. Затем добавляют поддерживающую среду, отличающуюся от ростовой величиной рН (7,4) и отсутствием сыворотки. Инфицированные ку. ьтуры инкубируют при 37 С. Через 36 ч наступает выраженное цитопатическое действие вируса, которое проявляется в виде округления клеток.

Для установления титра вируса готовят пробирочный материал. Для этого суспенэию клеток КМЭКр-85 в концентрации 150 тыс, кл/мл разливают по пробиркам и через сутки, когда на поверхности пробирок образуется монослой клеток, вносят вирус в раэ44797

Составитель А.Маныкин

Техред М.Дидык Корректор И.Муска

Редактор И.Дербак

Заказ 470

Тираж 487

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

5 15 личных разведениях. Титр вируса ИРТ в культуре КИЭКр-85 составляет 57 1 0 TIUiso, Пример 2. Культивирование вирусов ринопневмонии (три штамма).

Клетки линии КМЭКр-85 культивируют и заражают вирусами ринопневмонии аналогично примеру 1. Титр вирусов в культуре составляет 5-7 18 ТЦД „

Пример 3. Культивировайие вируса артериита лошадей.

Перевиваемые клетки линии КМЭКр-85 культивируют аналогично примеру 1.

Титр вируса составляет 5-7 1g ТЦД„,„„.

Пример 4. Культивирование вируса парагриппа-2 крупного рогатого скота, аттенуированный штамм.

Клетки линии КМЭКр-85 культивируют и заражают аналогично примеру 1. Титр вируса ПГ-3 в культуре составляет

5-7 18 ТЦД о)мл °

Пример 5. Культивирование реовируса 3-ro типа.

Перевиваемый клетки линии КМЭКр-85 культивируют и заражают вирусом аналогично примеру 1. Заражают вирусом из расчета 0,001 ТЦП, „„. Титр вируса составляет 5-7 1g ТЦЛ, „„.

Пример 6. Культивирование вируса диареи крупного рогатого скота.

Клетки линии КМЭКр-85 культивируют аналогично примеру 1. Заражают вирусом из расчета 0,001 ТЦД, „„ . Титр вируса диареи составляет 5-7 18 ТЦД,,, Полученный новый штамм неприхотлив к питательным средам, в течение

3-5 пассажей легко адаптируется к новым средам, например, 0,57-ному раствору ФМГс и гемогидролиэату отечественного производства. Вместо эмбриональной или телячьей сыворотки для клеток КМЭКр-85 используется более дешевая и доступная сыворотка крупного рогатого скота. Применение клеток

КМЭКр-85 в биологической промьпплен20 ности для культивирования вирусов приводит к уменьшению экономических затрат на питательные среды и сыворотку.

25 Формула изобретения

Штамм культивируемых перевиваемых клеток кожно-мьппечной ткани эмбриона кролика ВСКК (СХЖ) 11 25, используемый

30 для выделения и накопления вирусов.