Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к поверхностному антигену возбудителя туляремии голарктической расы

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для серологической идентификации возбудителя туляремии голарктической расы. Штамм получают путем слияния клеток миеломы Р3-Х63/AG8.653 с клетками селезенки мышей, линии BALB/с и депонирован под номером ВСКК(П) N 238Д. Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с добавлением 20% телячьей эмбриональной сыворотки при 37°С. Клетки пассируют один раз в 3-4 дня

коэффициент рассева 1:4-1:5. Секретируемые монАТ относятся к классу JGM, а титр их в культуральной жидкости составляет 1:100(НИФ), 1:1000-1:2000 (ИФА), в асцетической-1:256000-1:512000 (ИФА) до 1:20000 (НИФ), ДО 1:10240 (РНГА). МОНАТ МОГУТ БЫТЬ ИСПОЛЬЗОВАНЫ В ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЦЕЛЯХ.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21 ) 4443959/30-13 (22) 20.06.88 (46) 07.02.90. Бюл. ¹ 5 (71 ) Ростовский-на- Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) А.С,Новохатский, В.Н.Козловский, И.Я.Черепахина, Л.П.Алексеева и В.Г.Соколов (53) 578.085.23(088.8) (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS; МЦ$С1ПДБ, ИСПОЛЬ

ЗУЕМЬП1 ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ NOHOKJIOHAJIhHblX

АНТИТЕЛ К ПОВЕРХНОСТНОМУ АНТИГЕНУ

ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУЛЯРЕМИИ ГОЛАРКТИЧЕСКОИ

РАСЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для серологической идентификации возбудителя туляремии голарктической расы.

Штамм получают следующим образом.

Белых мышей иммунизируют внутрибрюшинно три дня подряд живой куль- турой вакционного штамма Francisella tularensis 15 Гайского в дозе 1100 м. кл/мышь и затем ревакцинируют внутрибрюшинно через 10, 11, 12 дней дозой 1 млн.м.кл. На четвертый день после последней иммунизации проводят соматическую гибридизацию клеток селезенки и мышиной миеломы РЗ-Х63/Ag

&.653. Слияние клеток миеломы с клет

„,80„„1541253 А 1 (51)5 С 2 Н 5/00, А 61 К 39/395

2 для серологической идентификации возбудителя туляремии голарктической расы. Штамм получают путем слияния клеток миеломы Р3-X63/Ag. 8.653 с клетками селезенки мышей, линии

Ва1Ъ/с и депонирован под номером

ВСКК(П) № 238Д. Клетки культивируют в среде RPMI 1640 с добавлением

20Х телячьей эмбриональной сыворото ки при 37 С. Клетки пассируют один раз в 3-4 дня, коэффициент рассева

1:4-1:5, Секретируемые монАТ относят ся к классу IgM а титр их в культу.ральной жидкости составляет 1;100 (НИФ), 1:1 000-1:2000 (ИФА), в асцетической — 1:256000-1:512000 (ИФА) до 1:20000 (НИФ), до 1:10240 (РНГА).

МонАТ могут быть использованы в диагностических целях. ками селезенки мышей проводят с помощью 50%-ного раствора голиэтиленгликоля с Mr 1500Д, В стерильных условиях извлекают селезенку и измельчают ее с помощью гомогенизатора типа Даунса. Взвесь фильтруют через два слоя марли и обрабатывают

0„83X-ным раствором МН101, забуференным трис-буфером для.лизирования эритроцитов. Лимфоциты дважды отмывают средой Игла-NFN и смешивают с дважды отмытыми клетками миеломы в соотношении 5:1 (клетки селезенки: миеломные клетки). Смесь клеток отмывают один раэ в 50-миллилитровой центрифужной пробирке, супернатант декантируют и к сухому осадку добав1541 253

55 ляют l мл 50%-ного раствора полиэтиленгликоля н течение 1 мин по каплям при 42 С (на водяной бане). После этого в центрифужную пробирку мед5 ленно вносят бессывороточную среду

Игла-NX в объеме до 20 мл„Взвесь о клеток инкубируют при 37 С 10 мин, после чего один раз центрифугируют при 800 об/мин 7 мин. Супернатант декантируют и смесь клеток осторожно ресуспендируют в 40 мл ростовой среды (среда RPMI 1640 или ДМЕ1 с добавлением 20Х телячьей эмбриональной сыворотки, 4 мМ/мл глютамина 4 г/л глюкозы, О, 1 M пирувата натрия, содер- жащей компоненты ГАТ (0,0131 мг/мл гипоксантина, 0,000191 мг/мл аминоптерина, 0,00385 мг/мл тимидина), Суспензию клеток в ГАТ-среде разлива- 0 ют по 0,1 мл в четыре 96-луночных плоскодонных культуральных плато на фицерный слой предварительно высеянных (эа сутки) перитонеальных макрофагов белых мышей в дозе 1 0000 на лунку, Видимые колонии гибридных клеток появляются на 7-1Одень. Гибридому культивируют 14 дней на среде ГАТ, затем 7-10 дней на среде ГТ, после чего переводят на ростовую среду без селективных компонентов . Гиб ридому дважды клонируют методом предельных разведений на фидере из мышиных пери" тонеальных макрофагов. В результате клонирования получают продуктивный штамм гибридных культивируемых клеток мыши, стабильно продуцирующих моноклональные антитела (монАТ) заданной специфичности.

Штамм обозначают ГТ-С7/65, он хранится в специализированной кол40 лекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П)

М 238Д и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Гибридные клетки ГТ-С7/65 представляют собой крупные округлые клетки с узким ободком базофильной цитоплазмы. Ядра гиперхромные, неправильно-овальной формы, крупные, с грубой структурой ядерного хроматина, В значительной части клеток цитоплазма имеет выросты.

Культуральные признаки типичны для перевиваемых клеток мышиных плазмоцитом. Клетки ГТ-С7/65 культивируют в виде стационарной суспензии при 37 С в пластиковой или стеклянной посуде при посевной pose 150200 тыс./мл в течение 3-4 дней до плотности насыщения 800 тыс./мл.

Клетки пассируют один pas в 3-4 дня той же дозой„ Коэффициент рассева

1:4-1:5. Культивирование ведут на питательной среде RPMI 1640 или

ДМЕМ, содержащей 10Х эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 8-10 мМ буфера HEPES.

Культивирование штамма в организме экспериментальных животных, Индукцию асцитных опухолей у интактных беспородных белых мышей и инбредных мышей линии Balb/c, внутрибрюшинно праймированных за 14 дней до введения гибридомы пристаном в дозе

0,5 мл/мышь„ осуществляют путем ино/кулирования 10 10 гибридных клеток на одно животное в 3 мл среды. Иммунную асцитическую жидкость собирают по мере формирования асцитных опухолей через 22-30 дней в объеме

2-17 мл. Культуру клеток поддержива- ют в течение трех пассажей асцитной опухоли на мышах (срок наблюдения).

Кариологические признаки, Модальное число хромосом 88, С-маркеры родительской миеломной линии

РЗ-Х63/Ag 8. 653.

Характеристика моноклональных антител. МонАТ относится к классу IgM.

Они выявляют поверхностный антиген, присутствующий на микробных клетках вирулентных и авирулентных штаммов возбудителя туляремии голарктической расы, но не на клетках среднеазиатской и неарктической рас. Антитела тестируют в реакции непрямой иммунофлуоресценции, иммуноферментном анализе, реакции непрямой гемагглютинации и реакции двойной иммунодиффузии с использованием живых и убитых формалином или фенолом микробных клеток. В качестве эритроцитарного диагностикума используют формалиниэированные, танизированные эритроциты барана, сенсибилиэированные фракцией слизистого вещества вирулентного штамма возбудителя туляремии голарктической расы. Класс иммуноглобу-. лннов определяют в реакции преципитации по Оухтерлони.

Титр монАТ в культуральной жидкости составляет 1:100 (НИФ), 1:10001:2000 (ИФА), в асцитической - 1:

1541253

Так нм о бра з ом, и редлаг аемый штамм является активным продуцентом монАТ, специфически взаимодействующим с поверхностным антигеном возбудителя туляремии голарктической расы, и может быть использован в диагностических целях.

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Итамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.mu sculus ВСКК(П)

Р 238 Д, ис поль з уемый для и олуче ния моноклональных антител к поверхностному антигену возбудителя туляремии голарктической расы, Составитель А, Маныкин

Техред М,Ходанич Корректор О. Кравцова

Реактор А. Мотыль йь.

Заказ 264

Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Проиэвод твенно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

: 25600-1: 5) 2000 (ИФА), до 1: 20000 (НИФ), до 10240 (РНГА) .

Контаминация, Бак те рии и грибы в культуре клеток не обнаруживаются.

Заражение микоплазмой не выявлено.

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в среде RPMI 1640, содержащей 50 эмбриональной телячьей сыворотки и )OX глицерина или )OX ди- 10 метилсульфоксида. Замораживание проводят в программном замораживателе со снижением температуры на 1 С (до

-40 С), далее на 10 С (до -100 С).

Затем клетки помещают в жидкйй 15 азот, Размораживание проводят быстро на водяной бане при 37 С. Жизнеспособность клеток по включению трнпанового синего составляет 75-92Х.

Пример 1. Культуру, выделенную от грызуна при эпизоотологическом обследовании природного очага туляремии, выращивают на плотной питательной среде с 0,)X цистеина. Готовят 1 млрд, суспензии клеток в

25 фосфа тном буферном рас тво ре (ФБР ) рН 7,4, из которой приготавливают мазки и фиксируют этанолом в течение

20 мин. На фиксированные мазки наносят по 1 капле препарата монАТ 30 конъюгированного с ФИТЦ. После инкубации 40 мин во влажной камере при

О

37 С препараты промывают в трех сменах ФБР рН 7,4 и один раз ополаскивают дистиллированнои водои Маз 35 ки высушивают на воздухе и затем просматривают иа люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ И-2 под иммерсией (об. 90 хок. 1 О) с использованием нефлуоресцирующего иммерсионного масла или ди- 4О метилфталата. Ярко-зеленое свечение на темном фоне мелких коккобактерий возбудителя туляремии расценивают как специфическое. При наличии специфического свечения при просмотре пози- .45 тивного контроля, основанного на использовании туляремийной люминесцирующей сыворотки, делают заключение о том, что выделенная культура относится к виду F. tularensis голарктической расы.

П р ч м е р 2. Изучаемую культуру обрабатывают аналогично примеру 1. На фиксированные мазки наносят по ) капле асцитного препарата монАТ и инкубируют в течение 4060 мин во влажной атмосфере при 37 С.

После этого проводят трехкратную отмывку препаратов ФБР рН 7,4 и однократно ополаскивают дистиллированной водой. Мазки подсушивают на воздухе, после чего наносят конъюгаткроличью антисыворотку против иммуноглобулинов мыши, меченную ФИТЦ, Masки с нанесенным антивидовым конъюга" том инкубируют во влажной камере о прн 37 С в течение 40-60 мин, после чего трехкратно отмывают ФБР рН 7,4 и однократно ополаскивают дистиллированной водой. Подсушенные на воздухе мазки просматривают и учитывают результаты аналогично примеру 1.