Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, используемый для получения моноклональных антител к термостабильному о-антигену холерного вибриона серовара огава

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для серологической идентификации возбудителя холеры серовара Огава. Цель изобретения - получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS MUSCULUS, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ) к термостабильному О-антигену холерного вибриона серовара Огава. Штамм получают гибридизацией клеток мышиной миеломы Р3-Х63/Ад8.653 с клетками селезенки мышей, иммунизированных бактериальной взвесью VIBRIO CHOLERAE штамм 3119 серовара Огава. Клетки культивируют на среде RPMI 1640 с 10% эмб. тел. сыв. пассируют 1 раз в 3 - 4 дня, коэффициент рассева 1:4-1:5. МонАТ относятся к классу Iдд, их титр в культуральной жидкости 1:2000 (ИФА), 1:60 (НИФ), в асцетической - 1:80000 (ИФА), 1:6000 (НИФ). МонАТ специфичны к термостабильному О-антигену штаммов серовара Огава и могут быть использованы в диагностических целях. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N 237 Д.

СОЮЗ COBEÒÑHÈÕ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 5/00, А 61 К 39/395

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для серологической идентификации возбудителя холеры серовара Огава.

Цель изобретения — получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus. musculus, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ) к термостабильному О-антигену холерного вибриона серовара Огава.

Штамм получают следующим образом.

Белых мышей иммунизируют внутрибрюшинно трехкратно с интервалом

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 4445531/30-13 (22) 20.06.88 (46) 07.02.90. Бюл. Р 5 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) О.С .Бурлакова, Л.П.Алексеева, А.С.Новохатский и К.Г.Бичуль (53) 578.085„23(088.8)

j(56) Teruyo Ito et al. Т. Clin.

Microbiol, 1 987, р. 2289-2295. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS. MUSCULUS, ИСПОЛЬЗУИ1ЫИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ YOHOKJIOHAJIbНЫХ АНТИТЕЛ, К ТЕРМОСТАБИЛЬНОМУ О-АНТИГЕНУ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА CEPOBAPA

ОГАВА (57) Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для серологической иденти- фикации возбудителя холеры серовара

Огава. Цель изобретения — получение

„„SU„„1541254 A 1

2 штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ) к термостабильному 0-антигену холерного вибриона серовара

Огана. Штамм получают гибридизацией клеток мышиной миеломы Р3-Х63/Ag

8.653 с клетками селезенки мышей, иммунизированных бактериальной взвесью ЧЕЪг1о cholerae штамм 3119 серовара Огава. Клетки культивируют на среде RPMI 1640 с 10% эмб.тел.сыв °, пассируют 1 раз в 3-4 дня, коэффициент рассева 1:4-1:5, МонАТ относятся к классу IgG, их титр в культуральной жидкости 1:2000 (ИФА), 1:60 (НИФ), в асцетической — 1:80000 (ИФА), 1:6000 (НИФ). МонАТ специфичны к термостабильному О-антигену штаммов серовара Огава и могут быть С использованы в диагностических целях.

Штамм депонирован под номером ВСКК (П)

N 237Д, 10 дней бактериальной взвесью холерных вибрионов серовара Огава, прогре той дри температуре 100 С в дозе 10 10 м.кл.

Бустерную инъекцию антигена про- " водят за 4 дня до гибридизации. Слияние клеток мьппиной миеломы Р3-Х63/Ag

8.653 с клетками селезенки мьппей проводят с помощью 50% полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500 Д.

В стерильных условиях извлекают селезенку и измельчают ее с помощью гомогенизатора. Взвесь клеток фильт154 I 2 54 руют через 2 слоя марли, а эритроциты разрушают 0,83 -ным раствором

NHqC1, забуференным трис-буфером.

Лимфоциты дважды отмывают средой

Игла-МИ1 и смешивают с дважды отмытыми клетками миеломы в соотношении

5:1 (клетки селезенки:миеломные клетки). Смесь клеток отмывают один раз в 50-миллилитровой .центрифужной пробирке, супернатант декантируют и к сухому осадку добавляют 1 мл 50 -ного раствора полиэтиленгликоля в течение 1 мин по каплям при температуре 42 С (на водяной бане). После это. го в центрифужную пробирку вносят медленно бессывороточную среду ИглаМНМ. Взвесь клеток инкубируют при температуре 3? С 10 мин, после этоFo супернатант декантируют H смесь клеток осторожно. ресуспендируют в

40 мл ростовой среды (среда ЯРМА

1640 или ДИЕМ с добавлением 20 телячьей эмбриональной сыворотки, 4мМ/мл глютамина, 4 г/л глюкозы, 0,1 М пирувата натрия), содержащей компоненты ГАТ (0,0131 мг/мл гипоксантина, 0,0001 91 мг/мл аминоптерина, 0,00385 мг/мл тимидина). Суспензию клеток в ГАТ-среде разливают по 0,1 мл в четыре 96-луночных плоскодонных культуральных плато на фицерный слой предварительно высеянных (за сутки) перитонеальных макрофагов белых мышей в дозе 10000 на лунку. Видимые колонии мышей гибридных клеток появляются на 7-10 день.

Гибридому. культивируют 14 дней на среде ГАТ, затем 7-10 дней на среде

ГТ, после чего переводят на ростковую среду без селективных компонентов. Гибридому дважды клонируют методом предельных разведений на фидере из перитонеальных макрофагов белых мышей. В результате клонирования получают продуктивный штамм гибридных культивируемых клеток мьппи, стабильно продуцирующкх NA заданной специфичности.

Итамм обозначают ГХ-В7/Or, он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических ,клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК(П)

11 237 и характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Гибридные клетки ГХ-В7/Ог представляют собой крупные оКруглые клетки с узким ободком базофильной цитоплазмы. Ядра гиперхромные, неправильно-овальной формы, крупные, с грубой структурой ядерного хроматина. В значительной части клеток цитоплазма имеет выросты.

Культуральные признаки типичны для перевиваемых клеток мышиных плазмоцитом. Клетки ГХ-В7/Or культивируют в виде стационарной суспензии о при 37 С в пластиковой или стеклянной посуде при посевной дозе 1001500 тыс./мл в течение 3-4 дней до плотности насьпцения 800-900 тыс.кл./мл.

Клетки пассируют один раэ в 3-4 дня. той же дозой. 1(оэффициент рассева

1:4-1:5. Культивирование ведут на питательной среде НРМХ 1640 или ДМЕМ, содержащей .1 0 эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мИ глютамина, 8-10 мМ буфера HEPES, 50 мкг/мл гентамицина.

Культивирование штамма в организ" ме экспериментальных животных. Индукцию асцитных опухолей у инбредных мьпней линии Ва1Ъ/с, внутрибрюшинно праймированных 14 дней до введения гибридомы пристаном в дозе 0,5мл/мышь, осуществляют путем инокулирования

301010гибридныхклетокнаодножиЕ вотное. Иммунную асцитическую жидкость собирают по мере формирования асцитных опухолей через 12-14 дней в объеме 2-6 мл. Культуру клеток поддерживают в течение двух пассажей асцитной опухоли на мьппах (срок наблюдения).

Кариологические признаки. Nopàëüное число хромосом 87, С-маркеры родительской миеломной линии

РЗ-X63/Ag 8.653.

Характеристика моноклональных ан» тител.

МонАТ относится к классу Тяб. Они выявляют О-антиген холерных вибрионов только серовара Огава, не давая перекрестной реактивности с вибрионами серовара Инаба и вибрионами не 01 группы и представителями близкород50 с твенных с емейс тв . Антитела тест ируют в реакциях непрямой и мунофлюоресценцйи„иммуноферментном методе, развернутой агглютинации, Ко-агглютинации и преципитации с использованием в качестве антигенного препарата термостабильного О-антигена холерных вибрионов сероваров Oraaa и Инаба. Класс иммуноглобулинов определяют в реакции преципитации по Оухтерлони.

30

Формула из об рет ения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus тпизси1из ВСКК(П)

Р 237Д, используемый для получения моноклональных антител к термостабильному О-антигену холерного вибриона серовара Огава.

Составитель А. Маныкин

Техред М.Ходанич Корректор О. Кравцова

Редактор А, Мотыль

Заказ 264- Тираж 498 Подп ис кое

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина, 101

5 15412

Титр монАТ в культуральной жидкости составляет 1:2000 (ИФА), 1:60 (НИФ), в асцитической — 1:80000 (ИФА), 1: 6000 (НИФ) .

Контаминация. Бактерии и грибы в

5 культуре клеток не обнаруживаются.

Заражение микоплазмой не выявлено.

Криоконсервирование. Клетки штамма ресуспендируют в среде RPM1 1640, содержащей 50 . эмбриональной телячьей сыворотки и 10 глицерина или 10 . диметилсульфоксида. Замораживание проводят в программном замораживатео ле со снижением температуры на 1 С (до -4С С), далее на 10 С (до -100 С) .

Затем клетки помещают в жидкий азот.

Размораживание проводят быстро на водяной бане при 37ОС. Жизнеспособность клеток по включению трипаново- 20 го синего составляет 78-92 .

Исследование специфичности монАТ., Для определения специфичности монАТ продуцируемых гибридомой

ГХ-Вг/Ог используют набор клонированных штаммов холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба и представителей семейств 7Итiопасеае, Pseuйошопайасеае, EntегоЪас1егiacеае, В качестве антигениых препаратов в исследуемых серологических реакциях используют живые и убитые кипяче" нием бактериальные клетки холерных вибрионов сероваров Огава и Инаба и близкородственных микроорганизмов.

При исследовании специфичности монАТ в реакции непрямой иммунофлуоресценции и иммуноферментном анализе установлено активное взаимодей54 6 ствие иммуноглобулинов с детерминантами О-антигена только штаммов серовара Огава.

В реакции преципитации антитела гибридомы ГХ-В7/Or образуют в агаре одну четкую линию преципитации с клетками холерных вибрионов серовара Огава и не взаимодействуют с клетками серовара Инаба и близкородственными микроорганизмами, При постановке реакции развернутой агглютинации монАТ, продуцируемые гибридомой ГХ-В7/Or, обладают способностью агглютинировать клетки холерных вибрионов серовара Огава в титрах до 1:8000.

Пример. Из исследуемой культуры, выделенной из объектов окружающей среды или от человека, готовят

1 млрд. взвесь. Каплю взвеси клеток наносят пипеткой на стекло и смешивают с каплей препарата монАТ, осто-, рожно покачивая стекло. Образование крупных агглютинатов в течение 30 с — °

5 мин свидетельствует о наличии в исследуемом образце холерных вибрионов серовара Огава.

Исполь зов ание монАТ, продуцируемых гибридомой, позволяет осуществлять раннюю и экспрессную диагностику возбудителя холеры.