Способ замораживания эмбрионов кур

 

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в криобиологии, генетике и клеточной инженерии. Целью изобретения является жизнеспособности эмбрионов. Согласно изобретению используют эмбрион на стадии конца бластулыначала гаструлы, который отделяют дополнительно от собственной желточной оболочки, выдерживают в течение 5-10 мин в 8-12%-ном растворе-α пропиленгликоля, затем охлаждают со скоростью 50-60 град/мин до начала процесса кристаллизации, выдерживают в течение 25-35 с и замораживают до - 18-22°С со скоростью 30-35 град/мин и до -79°С со скоростью 95-105 град/мин. После размораживания выдерживают в солевом растворе в течение 5-10 мин и трансплантируют для культивирования на подложку, в качестве которой используют желточную оболочку. 6 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) А 01 N 1/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4450600/30-13 (22) 27.06.88 (46) 23.03.90. Бюл. 11 (71) Украинский -научно-исследовательский институт птицеводСтва (72) Н.И.Сахацкий, А,И.Михайлик и А.Н.Новиков (53) 664.8.037.5(088.8) (56) Смит О. Биологическое действие замораживания и переохлаждения. М»:

ИЛ, 1963, с. 175.

Gonzales F. Luyet В. Resumption

of development in chick embryos after Еreezing. — Biodynamica, 1954, vol 7, И 145, р. 181 192. (54) СПОСОБ ЗАМОРАЖИВАНИЯ ЭМБРИОНОВ

КУР (57) Изобретение относится к биологии и может быть использовано в криоИзобретение относится к области биологии и может быть использовано в криобиологии, генетике и клеточной инженерии .

Цель изобретения — повышение жизнеспособности эмбрионов.

Способ осуществляется в следующей последовательности.

Объектом исследований служат эмб» рионы на стадии конца бластулы - начала гаструлы, источником которых являются свежеснесенные яйца кур породы род-айланд.

Для выделения эмбриона на желток, помещенный B чашку Петри бластодис„„SU„„1551315 А 1

2 биологии, генетике и клеточной инженерии. Целью изобретения является повышение жизнеспособности эмбрионов, Согласно изобретению используют эмбрион на стадии конца бластулы - начала гаструлы, который отделяют дополнительно от собственной желточной оболочки, выдерживают в течение 5 . i0 мин в 8-123-ном растворе с -пропиленгликоля, затем охлаждают со скоростью 50-60 град/мин до начала процесса кристаллизации, выдерживают в течение 25-35 с и замораживают до

-(18-22) С со скоростью 30-35 град/

/мин и до -79 С со скоростью 95105 град/мин. После размораживания выдерживают в солевом растворе в те-. чение 5-10 мин и трансплантируют для культивирования на подложку, в качестве которой-используют желточную .оболочку. 6 табл. ком вверх, накладывают кольцо из фильтровальной бумаги, при этом стремятся k тому, чтобы бластодиск оказался в центре кольца. Поджелточную оболочку инъецируют физраствором в количестве до 5 мл (используют в качестве физраствора 0,9ь-ный .раствор хлористого натрия, растворы Рингера, Говарда, Тироде и т.д.). Затем обрезают желточную оболочку по наружному краю кольца и переносят препарат в другую чашку Петри с физраствором.

Колебательными движениями в растворе смывают эмбрион с желточной оболочки.

Отделенный таким путем от собственной

1551315

Табли ца 1

Жи з неспособност ь эмбрионов при продолжительности выдержки, мин

1 / ентракриотектоо

0 0

0 0

3 22

16 23

19 25

21 26

20 20

24

26

23

1 5

2 - 7

3 8

4 10

5 11

6 12

7 15

0

7

13

12 желточной оболочки эмбрион пипеткой

c ереносят в другую чашку Петри с 824 oL -пропиленгликоля на растворе

Говарда, выдерживают 5-10 мин, затем

Переносят в контейнер для замораживания, в качестве которого импользуют

k примеру алюминиевый цилиндр диаметром 11 мм и высотой 2 мм.

Эмбрион в контейнере в укаэанном

8-12 -ном растворе криопротектора охлаждают со скоростью 50-60 град/мин о начала процесса кристаллизации, ыдерживают в течение 25-35 с и замоаживают до (-18)-(-22) С со скоросью 30-35 град/мин и до -79 C со коростью 95-105 град/мин. Скорость охлаждения контролируют с помощью контрольно-измерительного устройства, к примеру термопары, подсоединенной 20 к самопишущему потенциометру ЛКС-4003. Замороженные эмбрионы хранят ри -79 С, используя в качестве хладагента твердую углекислоту. Разморажи-! вание проводят путем помещения кон- 25 гейнеров с эмбрионами. в раствор Говарда при 18-22 С. После этого эмб рион выдерживают в течение 5-10 мин в солевом растворе (растворе Говарда) для отмывки его от криопротекто ра. Перед размораживанием эмбриона подгота вли ва ют желточ ную оболочку.

Вначале ее отделяют от желтка (используют пищевые, неоплодотворенные, а также любые другие дешевые яйца). Для этого на желток накладывают коль цо из фильтровальной бумаги, врутренний диаметр которого на 2-3 мм должен превышать наружный диаметр используемого для культивирования ка- 40 меры. Под кольцо инъецируют физраствор в количестве до 5 мл, а затем обрезают желточную оболочку по наружной стороне кольца и переносят в чашку Петри с Физраствором. С помощью 4g скребка очищают желточную оболочку от остатков желточной массы и укладывают внутренней стороной вверх на камеру для культи ви рова ния. Камеру для культивирования перед этим заполняют питательной средой, как и в известном способе °

Размороженный эмбрион пипеткой с расширенным до 4-5 мм концом переносят на желточную оболочку. При этом стремятся к тому, чтобы эмбрион лег на желточную оболочку дорсальной стороной. Если же он лег вентральной стороной или завернулся, тонкой стеклянной палочкой приводят его в нужное положение. Затем с помощью тонкой пипетки удаляют остатки .Физраствора вокруг эмбриона. После этого проводят культивирование эмбриона .известным способом. Первый контроль за развитием эмбриона проводят через 1214 ч культивирования.

В описании приведены данные, обосновывающие граничные пределы продолжительности выдержки эамбрионов в растворе криопротектора до замораживания и в соленом растворе после размораживания, а также режима охлаждения, выдержки s течение периода криса таллизации .и замораживания до -79 С.

Устойчивость эмбрионов к замораживанию зависит и от продолжительности их выдержки в процессе кристаллизации. При выдержке в течение 25-35 с

25-?63 эмбрионов сохраняют жизнеспособность, тогда как при выдержке менее 25 с число жизнеспособных составляет 3-53, а более 35 с - 15-183.

Жизнеспособность, 3 от общего числар деконсервированных эмбрионов в зависимости от продолжительности контакта до замораживания с криопротектором в различной концентрации приведена в табл. 1.

0 0 0 0

3 3 7 10

24 17 12 13

24 20 15 12

23. 19 11 9

23 18 8 6

18 15 6 3

1

Продолжение табл,2

Жизнеспособность деконсервированных эмбрионов, 3 от их общего числа, в зависимости от скорости охлаждения до начала процесса кристаллизации приведена в табл. 2.

1551315

Табли ца 2

С корост ь охлаждения, град/мин

Опыт

Количество эмбрионов, 10

Жизнеспособность деконсервированных эмбрионов, 3 к их общему числу, в зависимости от скорости их заморажи" вания от начала процесса кристаллиза= ции до (-18) - (-22) С приведена в табл. 3.

2

23

22

Табли ц.а 3

Количество эмбрионов, Ф, при температуре, до которой проведено замораживание, ОС

-17 -18 -20 -22 -23 -25

Опыт Скорость замораживания, град/мин

-1.5

3

5

Выход, 3, жизнеспособных эмбрионов в зависимости от скорости их замораживания от (- 18) -(-22) С до -79:С приведен в табл, 4. растворе после размораживания приведена в табл. 5.

Табли иа 5

40 Опыт

Та бли ца 4

Количество эмбрионов, 3

Продолжительность выдержки, мин

Опыт

Скорость замораживания, град/мин

Количество эмбрионов, 3

3

5

Во 6

В табл. 6 приведены данные сравнительных испытаний эффективности замораживания куриных эмбрионов известным и предлагаемым способами. Они свидетельствуют о существенном преимуществе предлагаемого способа перед известным.

Прикрепляемость эмбрионов к желточной оболочке в зависимости от продолжительности их вьдержки в солевом

2

4

6

115

9

8

5

21

23 .25

26

24

12 .10

8

4

6

19

23

3

5

11

14

23

26

21

16

24

24

26

16

18

26

26

23

13 10

16 10

20 11

20 12

18 14

1551315

Табли ца 6

Количество эмбрионов, сохранивших жизнеспособность после разморажи ва ния

Способ замораживания

Заморожено эмбрионов, шт, Г шт.

16,7

26,0

Известный

Предлагаемый

21

Формула изобретения

Составитель И.Тареева

Техред Л.Сердюкова Корректор M.Иаксимишинец

Редактор В.Данко

Заказ 288 Тираж 434 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКЙТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб;, д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул. Гагарина,101

Способ замораживания эмбрионов

gyp, включающий отделение эмбрионов

Ьт желтка, отмывку от желточной мас20 ы, выдержку в растворе криопротектора, охлаждение, о т л и ч а ю-!

Щ и и с я тем, что, с целью повышения жизнеспособности эмбрионов, ис- 25 пользуют эмбрионы на стадии конца бластулы - начала гаструлы, дополнительно проводят отделение от желточ" ной оболочки, в качестве криопротектора используют 8-123-ный раствор

g,-пропиленгликоля, выдерживают в течение 5-10 мин, охлаждение ведут в три стадии: вначале со скоростью

50-60 град/мин до начала кристаллизации,при которой выдерживают 25-35 с,а затем со скоростью 30-35 град/мин до (-18)-(-22) С и со скоростью 95105 град/мин до -79 С.