Способ генотипирования реассортантов вируса гриппа

 

Изобретение относится к молекулярной вирусологии и может быть использовано для типирования вирусов гриппа. Целью изобретения является увеличение чувствительности способа типирования реассортантов вируса гриппа. Увеличение чувствительности достигается тем, что на фильтрах иммобилизуют вирусный лизат, в гибридизационную систему вносят дополнительную конкурирующую РНК из эталонных штаммов, тестирование результатов проводят с помощью денситометрирования, а типирование проводят на основе сравнения полученных данных со значениями для внутренних стандартов. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) А1 (51) 5 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4382523/30-13 (22) 23,02.88 (46) 28.02.90. Бюл. Y 8 (71) Всесоюзный научно-исследователь. ский институт гриппа и Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научно-производственного объединения "Вектор" (72) Ф.Н.Золотарев, Л.Б.Голубев, Н.А.Петров и Л.В.Мамаев (53) 577.2(088.8) (56) Pljusnin A,Z, et al. Virol, 1987, 38, N 2, 111-114. (54) СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАИИЯ РЕАССОРТАНТ0В ВИРУСА ГРИППА (57) Изобретение относится к молеку"

Изобретение относится к молекулярной биологии, а именно к молекулярной вирусологии, и может быть использовано для типирования вирусов гриппа.

Целью изобретения является увеличение чувствительности способа типирования реассортантов вируса гриппа.

Увеличение чувствительности достигается тем, что на фильтрах иммобилиэуют вирусный лизат, в гибридизационную систему вносят дополнительно конкурирующую PHK из эталонных штаммов, тестирование результатов проводят с помощью денситометрирования, и типирование проводят на основе сравнения полученных данных со значениями для внутренних стандартов.

Пример l. Определение родительской принадлежности гена нуклеопротеина NP у лабораторных реассортантов.

2 лярной вирусологии и может быть использовано для типирования вирусов гриппа. Целью изобретения является увеличение чувствительности способа типирования реассортантов, вируса гриппа, Увеличение чувствительности достигается тем, что на фильтрах иммобилизуют вирусный лизат, в гибридизационную систему вносят дополнительную конкурирующую РНК из эталонных штаммов, тестирование результатов проводят с помощью денситометрирования, а типирование проводят на основе сравнения полученных данных со значениями для внутренних стандартов.

2 табл.

Изучают две группы лабораторных реассортантов с их родителями: роди-,2 тельские вирусы А/Ленинград/9/46

Эций (ЙОМ) и А/СССР/2/85 (H3N2) и их ре- С73 ассортанты N 18, 11 24, 10 25, t 32, вфЬ родительские вирусы А/Ленинград/134/ ф3

17/57 (H2N2) и А/Новошахтинск/3/86 Isgh (H)N1) и их реассортант 1 3; а также (ф

5 эталонных штаммов: АIРК/8/34 ф (H0N1), А/Хабаровск/74/77 (Н1111), А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Гонконг/, /1/68 (H3N2) и А/Киев/59/79/Е(Н1N1), на основе которого получают молекулярные зонды.

Вирусы накапливают в аллантоисиой 3 полости 10-дневных куриных эмбрионов.

4,5 мл аллантоисной жидкости с вирионами осветляют центрифугированием в течение 30 мин при 10000 об/мин (12000 g), после чего вирус осаждают на дно центрифугированием в том же

1546486 роторе 30 мин при 40000 об/мин (200000 g) . Жидкость сливают и к вирусной бляшке приливают 45 мкл буфера: 40 мМ трис-НС1, рН 7,3, содержащего 250 мкг/мл протеинаэы К. Суспензию помещают в термостат при 37 С, время от времени пипетируя. Через

2 ч добавляют равный объем 0,5<-ного раствора додецилсульфата лития и оставляют при 37 С. Через 30 мин: пробирки с лизированными вирионами помещают в ледяную баню, По шаблону на

96 ячеек иэ каждой пробирки наносят в 2 точки по 2 мкл лизата на 8 предобработанных фильтра ° Предобработанные фильтры получают следующим образом: из нитроцеллюлоэных фильтров вырезают прямоугольники размером

77 х 117 мм, смачивают дистиллированной водой, которую затем замещают

20 х SSCp после чего Фильтры высушивают на воздухе ° Для удобства на всех фильтрах схема нанесения препаратов идентична . Две ячейки используют для определения уровня фона и на них вРНК не наносят.

Для иммобилизации вРНК лизированных вирионов после нанесения всех препрепаратов фильтры отжигают 2 ч при щ

80 С в вакууме, затем промывают в воде от солей, придающих фильтрам высокую хрупность, и высушивают на воз-духе.

В качестве молекулярного зонда используют ДНК плазмиды pBR1-NP/2, несущей полноразмерную ДНК вЂ” копию гена нуклеопротеина (NP} рекомбинантного штамма А/Киев/59/79/Р (Н1Г11), происходящего от эпидемического вируса

А/Киев/59/79/HEN1), приобретенного последним в результате реассортации с природными эпидемическими вирусами сероподтипа H3N2, L!ITBMM Е. coli

НВ101, содержащий указанную плаэмиду, 45 выращивает в О, 5 л 1 -ной среды ВН1 до поздней логарифмической фазы, бактериальные клетки собирают центрифугированием при 3000 g в течение

10 мин, плаэмидную ДНК выделяют щелочным методом с дополнительной очисткой равновесным центрифугированием в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием при 200000 g и 20 С в течение 36 ч. Для работы отбирают нижнюю полосу иэ градиента с кольцевой ковалентно замкнутой плаэмидной

ДНК, которую метят - Р в стандартной реакции ник-трансляции, От непрореа1

A(„2

А(о, 4 (ч, ио,к)

- А, Npi 4> (О2, gp Н)

2 не,н) + А(ч2, кр,u) (ч, 4p,í)

A(OINED )

2 (ч" мин) Аг тб» йе,н ги рова вших трифосфа тов освобождаются г ел ь-фил ь тра ци ей, Предгибридизацию мембран в течение E -3 ч ведут в 2 мл буфера для гибридизации состава: 50>-ный формамид, 6 х SSC, по 0,02 бычьего сывороточного альбумина, фиколла и поливМ нилпир ролидона . кРНК для конкурентной точечной гибридизации выделяют из куриных эмбрионов, зараженных эталонными штаммами, стандартными Фенольно-детергентным мет одом. На один фильтр необходимо около 100 мкг конкурирующей

РНК, которую осаждают центрифугированием из-под спиртового раствора в течение 10 мин при 3000 g и высушивают в вакууме к моменту получения Ð-меченого молекулярного зонда. К трем пробиркам, содержащим по 100 мкг высушенных осадков вРНК одного из эталонных штаммов: А/Хабаровск/74/77 (H1Nl), А/Сингапур/1/57(Н2Г12) или

А/PR/8/34 (HONE), добавляют по 80 мкл

Формамида и по 20 мкл водного- раствора P-ДНК плаэмиды рВР1-ИР/2. ПроЗ2 бирки прогревают на кипящей водяной бане в течение 1,5 мин, добавляют по 2 мл гибридизационного буфера, полученный раствор вливают в полиэтиленовые мешочки с фильтрами в гибридизационном буфере и помещают в термастат на 42 С, Через 16-20 ч мембраны дважды отмывают раствором 2 х SSC при комнатной температуре и дважды промывочным раствором (0,13 SDS

О>1 х SSC) при 55-60 С. После высушивания проводят авторадиографию с рентгеновской пленкой. Каждую проявленную пленку дважды сканируют при

450 нм на денситометре, представляющем значения оптической плотности для каждой точки.

Для обсчета полученных данных проводят усреднения и вычитают фон радиоавтографа. Тогда средняя оптическая плотность А(„ „р „1, пропорциональная количеству прогибридиэованного зонда NP c PHK вируса при наличии в гибридиэационном буфере конкурирующей кРНК одного из эталонных вирусов Н равна: где А, 01, 5 154648

A2 - значения оптической плотности соответственно при первом и втором сканировании данного радиоавто- 5 графа;

У - индексы, соответственно первого и второго нанесений лиэата вируса, NP — индекс гибридизации с плазмидой, несущей ген, NH - индекс гибридизации с введением конкурирующей кРНК одного из четырех эталонных штдммов1 при 15 нимает следующие значеяия: 0 — при внесении кРНК вируса A/PR/8/34

{H0N1) ; 1 .- при внесении кРНК вируса А/Хабаровск/ 20

/74/77 (H1N1) 2 - при внесении кРНК вируса

А/Сингапур/1/57 (H2N2)

3 - при внесении кРНК вируса A/Ãîíêoíã/1/68 25 (H3N2) i

02 — индексы соответственно

6 б первой и второй точек без PHK.

Условия гибридизации с равными фильтрами различны, посксльку зонд реагирует с различными кРНК с разной эффективностью в зависимости от отличий в их нуклеотидных последовательностях. Поскольку РНК NP гена эталонного вируса A/Êèåâ/59/79/R имеет 1004 гомологию с клонированной последовательность NP гена молекулярного зонда, за точку отсчета принимают уровни гибридизации для укаэанного вируса. Для каждого вируса определяют величину относительной денситометрической эффективности гибридизации (ОДЭГ):

ОДЭГ (4) = - - -- x 100, (М, HP, Н) где К - индекс для вируса A/Êèåâ/59/79È.

Для определения принадлежности NP генов анализируемых штаммов для анализируемых штаммов, а также для эталонных штаммов вычисляют нормированные отношения денситометрических эффективностей гибридизации (НОДЭГ):.

ОДЭ ч р к х 100 (ч мр) ОДЭГ(+ ОДЭГ(g) + ОЛЭГ(v H) о)

ОДЭГ(ч мр,1) х 100

«. » ь « »

ОДЭГ(ч ar 1) + ОДЗГ(ч HP ) + ()ЛЭГ(ч р,o)

0$3CggH р, дд х .1 0 0

ОЯЭГ(„„Р „+ ОЛЭГ(ч,„Р,,) + ГРЭГ(ч,, „)

Сравнивают полученные значения лиэ полученных результатов, о т л и

НОДЭГ анализируемых штаммов со значе- ч а ю шийся тем, что, с целью ниями НОДЭГ эталонных или родитель- увеличения чувствительности способа „ ских штаммов и относят изучаемый ви- на фильтрах иммобилизуют вирусный ли»

40 рус к тои или инои группе методом на- эат в гибридизационную систему, содерименьших квадратов (см. табл, 1, 2) . жащую плазмиду pBR1-NP/2, вносят дополнительную конкурирующую РНК иэ

Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я эталонных штаммов, тестирование реСпособ генотипирования реассортан- зультатов проводят с помощью денси,отов вируса гриппа, включающий накоп- "5 метрии, на основании полученных зналение и концентрирование вируса, им- чений оптической плотности опредег ат мобилизацию рНК-содержащего материала параметры нормированной относительной на фильтрах, точечную гибридизацию денситометрической эффективности r.<бg дНК-зондами, авторадиотрафию и ана- ридизации НОдЭГ по формулам

А(ч, s,H )

=-- ---",--" х 100

НОДЭГ

У1 в

А (»vÄs, н1) А.(ч, в,н") А(.с, s,н ) (@ H ) A(k,S,HO) А(к, S H3) (Ч S н ) х 100

А(к s н )

А

Ю «у 1

„„ Я,„ )» + (, Йg» 5 н (v H A(H H (w.s ) "(x,s,н ) "(к,s,н ) 1546486

"1 s,ísi

А(чэ м1! - -- з ! к.s, н ) 100

Г s А (1 Н ) ((6,Я ) е», (I%4 s6 H 1 @ (1r, s, Ê ) гдеАсреднее значение оптической плотности индекс использования в гибридизации молекулярного зонда 10 с ДНК-копией сегмента S; индекс анализируемого вируса, индекс вируса, сегмент кото" рого имеет максимальную среди анализируемых вирусов гомоло- 15 гию с использованным в реакции зондом, Н - индекс гибридизации с введением конкурирующей РНК одного иэ эталонных штаммов, и с помощью метода наименьших квадратов производят отнесение тестируемого штамма к соответствующему эталонному . сероподтипу.

КТабаи ца1

Определение родительской принадлежности гена нуклеопротеина NP у лабораторных реассортантов

Родитель

Сероподтипопринадлежность (Н) НОЛЭГ„ (Штамм

А/Ленинград/9/46

А/Ленинград/9/46

A/СССР/2/85

A/Ëåнинград/9/46

A/Ëåíè íãðàä/134/17/57

Табли ца2

Определение родительской принадлежности генов у лабораторных реассортантов с помощью конкурентной гибридизации

Ген»

Вирус

М

2 3 4 5 6 7 8

РВ2 РВ1 PA НА ИР NA И NS

А/СССР/2/85 (H3N2)

А/Ленинград/9/46 (НОЯ )

М 18

Е 24

И 25

" 32

С С

Л Л

Л Л

Л Л

С С

Л. Л

C С С С С С

Л Л Л Л Л Л

Л С Л fl Л Л

Л С Л С Л Л

Л С С С,,Л-Л. Л С Л С,Л Л

A/PR/8/34

А/Хабаровск/74/77

А/Сингапур/1/57

А/Гонконг/1/68

А/Ленинград/9/46

А/СССР/2/85

Н 18

У 24

У 25

N 32

A/Ëåíèíãðàä/134/17/57

А/Новошахтинск/3/86 3

52:37:11

18:26:56

38:11;51

34:33:33

61:30:09

38:37:25

63:25:11

53:32:15

40:29."31

50:39:11

36:12:52

21:30:49

35: 12: 53

1

3

3

0

0

1

1 546486

Продолжение табл.2

Вирус

Ген

1 2 3 4 5 6 7 8

РВ2 РВ1 PA НА NP NA И Ы

А/Ленинград/134/17/57(H2N2) Лд Лд Лд Лд Лд Лд Лд Лд

А/Новошахтинск/3/86 (H1Nl ) Н Н Н Н Н Н Н Н 3 Лд Лд Лд Н Лд Н Лд Лд «С - принадлежность сегмента штамму А/СССР/2/85(H3N2)

ll - принадлежность сегмента штамму A/Ëåíèíãðàä/9/46 (HONl), Лд - принадлежность сегмента штамму А/Ленинград/134/17/57 (H2N2), Н - принадлежность сегмента штамму A/Íîsîøàõòèíñê/3/86 (H1Nl ) .

Составитель А,Спундэ

Техред A.Êðàâ÷óê Корректор.О.Ципле

Редактор Т.Лазоренко

Тираж 494 Подписное

Заказ 56

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113935, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул.Гагарина, 101