Рекомбинантная плазмидная днк @ 24, кодирующая синтез рестриктазы и метилазы s @ 11 и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент рестриктазы и метилазы s @ 11

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, обуславливающую синтез рестриктазы и метилазы SSOII и штамм, содержащий эту рекомбинантную ДНК - продуцент рестриктазы и метилазы SSOII. Цель изобретения - увеличение уровня синтеза рестриктазы и метилазы SSII. Изобретение позволяет получить штамм с продукцией рестриктазы и метилазы SSOII - 350000 и 400000 ед. на 1 г сырой биомассы соответственно. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1

„,SU,, 15392 (51) 5 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Целью изобретения является увеличение синтеза рестриктазы и метилазы SsoII

Поставленная цель достигается .плазмидой d 24 и штаммом Е.coli

В834, содержащим эту плазмиду.

Плаэмида d 24, кодирующая рестриктазу и метилазу SsoII. состоит иэ следующих элементов: плазмидная ДНК вектора pUC19 размером 2,69 тпо; плазмидная ДНК Р4 иэ S. sonnei 47-, кодирующая рестриктазу и метилазу

SsoII, размер которой 4,4 тпо.

Штамм — продуцент рестриктазы и метилазы SsoII получен трансформацией клеток Е.coli В834 плазмидой d 24.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4394464/30-13 (22) 18,03.88 (46) 30.01 .90. Бюл. М - 4 (71) Научно-исследовательский институт медицинской энзимологии АМН СССР и Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова (72) С.С. Дебов, А.С. Карягина, В.Г.Лунин, Н.Г.Лопатина, И.И. Грубер, В.М.Поляченко и И.И.НикольскаяСанович (53) 577.224.2.757.2(088.8) (56) Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1 987, т.1 2, с.26-29 °

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинатную плазмидную ДНК, обуславливающую синтез рестриктазы и метилазы SsoII и штамм, содержащий эту рекомбинантнун ДНК вЂ” продуцент рестриктазы и метилазы Язо??.

Рестриктаза и метилаза SsoII узнает 5-членную вырожденнун последова-. тельность CCNGG, гидролизует ДНК с. образованием 5-членньтх липких концов, обеспечивая высокую эффективность при лигировании, и метилирует центральный цитозин в последовательности узнавания CCNGG, образуя модифицированное основание 5-метилцитозин °

2 (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК .

d 24, КОДИРУЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕСТРИКТАЗЫ

И МЕТИЛАЗЫ SsoII И ШТАММ БАКТЕРИЙ

ESCHERICHIA C0LI - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ И МЕТИЛАЗЫ БзоП. (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, обуславливающую синтез рестриктазы и метилазы SsoII и штамм, содержащий эту рекомбинантную ДНК вЂ” продуцент рестриктазы и метилазы SsoII. Цель изобретения — увеличение уровня синтеза рестриктазы и метилазы SsoII.

Изорретение позволяет получить штамм с продукцией рестриктазы и метилазы

SsoII — 350000 и 400000 ед.на 1 г сырой биомассы соответственно.1 табл.

1539205

Содержание рестриктазы БяоТХ в сконструированном штамме равно 350000 ед. /г биомассы клеток, метилазы 400000 ед.

Пример 1. Плазмидную ДНК иэ штамма Е. coli XS13 содержащего две плаэмиды. Р4 и Р9, выделяют щелочным методом. Отделение ДНК плазмиды Р4 от высокомолекулярной ДНК Р9 проводят методом колоночной хроматографии на

ДЕАЕ-целлюлозе.

Полученный препарат плазмиды Р4 и препарат вектора pUC19 используют для конструирования плазмиды и 24, которое проводят следующим образом. 15

0,5 мкг ДНК вектора pUC19 инкубируют с эндонуклеазой рестрикции

Ба1С1 (5 ед.) в буфере,А .(100 мМ

NaC1, 50 мМ трис-НС1, рН 7,5; )О мМ

MgC1<, 1 мМ дитиотрейтол). 5 мкг ,плазмиды Р4 инкубирук1т с рестриктазой SalGl (10 ед.) в буфере A.Реакции проводят при 37 С 1 ч. После инкубации пробы прогревают при 65 С 15 мин. Анализ полноты гидролиза про- 25 водят с помощью электрофореэа.

Соединение ДНК плазмиды и вектора проводят в буфере: 0 05 M трис-HCl рН 7,4; 0,01 M MgC1<, 1 мМ дитиотрейтол; 0,1 мМ АТФ с добавлением ДНК.- 30 лигазы фага Т4 (1000 ед/мл) иэ расчета 0,5 мкл фермента на 5 мкг ДНК в течение 12 ч при 10 С.

Полученную смесь соединенных фраг ментов используют при трансформации ,êëåòîê Е,coli PS200. Трансформацию проводят следующим образом. 50 мкл суспенэии клеток Е.coli PS200 вносят 40 в 20 мкл жидкой питательной среды LB и выращивают при 37 С до титра

7 «10 кл/мл. Клетки охлаждают во льду

10 мин и центрифугируют при 5000 g в течение 10-15 мин при 4 С, затем тща- 45 тельно сливают супернатант. осадок суспендируют в 0,5 мл 0,1 М СаС1 .

Клетки выдерживают во льду 10-12 ч, после чего используют для трансформа.— ции.

На 200 мкл суспендированных клеток Е.coli PS200 берут менее 20 мкл соединенных фрагментов ДНК и инкубируют 40 мин во льду, затем в течение

90 с при 42 С и опять 2 мин во льду, 55 добавляют 1,8 мл бульона LB -и инкубируют 1 ч при 37 С. Затем 2 мл суспензии трансформированных клегок центрифугируют в течение 3 с в центрифуге "Эппендорф" при комнатной температуре и ресуспендируют в 100 мкл

LB с 0,01 M MgSO . В пробу добавляют

100 мкл суспензни фага Р Ь 221 с титром 2,5 «10 и инкубируют в течение

20 мин при 37 С. Затем клетки высевают на чашки с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл.

Из клеток клонов, выросших на чашках с ампициллином, выделяют плазмидную ДНК, обозначенную d 24 и содержащую в своем составе вектор pUC19, несущий ген В1а, определявший устойчивость к ампициллину, и плаэмидную

ДНК Р4, несущую гены рестриктазы и метилаэы SsoII. Выделенную плазмидную ДНК d 24 подвергают рестрикционному анализу.

Пример 2, Определение присутствия рестриктазы и метилазы SsoII в штамме Е.coli PS200, содержащем плазмиду d 24.

0,1 r биомассы E.coli PS200, содержащей плазмиду d 24, суспендируют

В 170 мкл 0,01 MM NNClg инкубируют при покачивании 2 ч при 4 С, центрифугируют при 10000 g 15 мин, затем 10 мкл супернатанта добавляют в пробу, содержащую 1 мкг бактериофага Я в 10 мкл буфера А. Пробу инкубируют 1 ч при 37 С, после чего анализируют электрофорезом в 1,2 ном агарозном геле. Картина рестрикции в случае штамма-Е. coli PS200, несущего плазмиду d 24, характерна зля рестриктазы SsoII.

1 мкг плазмидной ДНК d 24, выделенной из штамма Е.coli PS200, обрабатывают 10 ед. рестриктирующей эн- . донуклеазы Scroll в буфере А в течение 2 ч при 37 С. Электрофорез показывает, что ДНК плазмиды d 24 при такой обработке не фрагментируется, в то время как плаэмида pUC19 дает картину гидролиза, типичную для плазмиды pUC19, обработанной рестриктаэой SsoII. Эти данные свидетельствуют о защите мест узнавания рестриктазы БзоТХ в d 24 метилированием.

Определение эффективности посева ! бактериофага Л Ь 221 на клетках штаммов, синтезирующих рестриктазу и метилазу SsoII проводят следующим образом.

Штамм Е.coli PS200, несущий плазмиду d 24, определяющую синтез рестриктазы и метилазы SsoII, снижает эффективность посева бактериофага

1539205 Ь 221 на 5 порядков по сравнению с эффективностью посева на нетрансформированном штамме K,coli PS200. После пассажа на клетках штамма Е.coll

PS200, трансформированных плазмидой

d 24, фаг Э.Ь 221 высевали на клетках штамма Е.coli PS200, несущие плазмиду d 24 и штамма Е.coli XSI3 синтезирующих рестриктазу и метилазу 10

SsoII. Снижения эффективности посева при этом не происходило, что свидетельствует о модификации ДНК фага

МЪ 221, происходящей в клетках Е.coli

PS200, трансформированных плазмидой 15

d 24.

Пример 3. Плазмиду d 24 трансформируют в штамме Е.coli B834 по методу, описанному в примере 1, и получают штамм — продуцент рестриктазы20 и метилазы SsoII.

Штамм Escherichia coli В834, несущий плазмиду d 24 — продуцент рестриктазы и метилазы SsoII, характеризуется следующими признаками, Культурально-морфологические. Клетки прямые, палочковидные, неподвижные, граматрицательные, лактозопозитивные.

При рассеве на чашки с 1,3Х-ным МПА рост в виде отдельных колоний, иног- 30 да в R-форме с неровными краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (NITA, MIIH, LB-бульон и LB-агар).

Физиолого-биохимические. Клетки растут в пределах 4-45 С при оптимуме рН 6,8-7,5. Штамм разлагает глюкозу, лактозу, маннит с образованнем кислоты, не разлагает сахарозу, сбраживает мальтозу, ксилозу, сорбит, 40 дульцит, рамнозу, образует индол и сероводород, проявляет устойчивость к ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды 4 24.

Пример 4. Культуру клеток 45

Е.coli В834, несущих плазмиду d 24, выращивают в 1 л среды 1В с 50 мкг/мл ампициллина при 37 С до титра 4 «

«10 > кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 1 5 мин). 50

1 r сырой биомассы суспендируют в

5 мл буфера, содержащего 50 мМ трисНС1, рН 7,6; 0,1 М NaC1; 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкг/мл лизоцима и выдерживают при 0 С 1О мин. Клетки разрушают ультразвуком. Экстракт поо лучают центрифугпрованием при .2 С (48000) в течение 1 ч.

Активность рестриктазы SsoII определяют в серийных десятикратных pasведениях супернатанта, 1 мкг ДНК фага Л в 30 мкл буфера A (см.пример 1) инкубируют с 2 мкл каждого разведения. Уровень активности рестриктазы

SsoII составляет 350000 ед.на 1 r биомассы.

Активность метилаэы определяют в реакционной смеси с общим объемом

lОО мкл, с держащей 1 мкг акцепторной ДНК, 0,5 МкКи з Н-S-аденозилметионина и 5 мкл каждого из десятикратных разведений супернатанта. Инкубацию проводят в течение различных временных промежутков от 1 до 24 ч при 37 С. Пробы наносят на фильтры

GF/Ñ, осаждают 5Х-ной трихлоруксусной кислотой, отмывают 70/-ным этанолом, высушивают и просчитывают радиоактивность в толуоловом сцинтилляторе. За единицу ферментативной активности принимают количество фермента, обеспечивающего полную модификацию 1 мкг акцепторной ДНК за

24 ч.

Уровень активности метилазы, определенный в штамме Е,coli В834, несущим плазмиду d 24, соответствует

400000 ед. на 1 r биомассы.

В таблице приведены значения уронней синтеза рестриктаэы и метилазы

SsoII в штаммах E.coli полученных трансформацией плазмиды d 24.

Изобретение позволяет получить уровень синтеза рестриктазы и метилазы

SsoII в штамме, содержащем плазмиду

d 24, не менее 350000 и 400000 ед. на

1 г биомассы соответственно.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК

d 24, кодирующая синтез рестриктазы и метилазы SsoII мол.м. 4,5 МД и размером 7,1 тпо, содержащая: плазмидная ДНК вектора pUC19 размером 2,7 тпо; плазмидная ДНК Р4 с геном рестриктазы и метилазы SsoII размером 4,4 тпо; по одному участку расщепления эндонуклеазами BglII, ClaI EcoRV, SacII, PstI, SphI, HindIII, SaGI, KpnI, SmaI, BamHI, XbaI; по два участка узнавания энцонуклеазами — Cfrl01, SalGl; четыре участка расщепления EcoRI;

Ьlа ген, кодирующий р-ëàêòàìàsó;

1539205

Активность, ед./г

Штамм рестриктазы метилазы

Е.coli Р$200/d 24 10000 12000

Е. col i В834/d 24 350000 400000

Составитель Т.Забойкина

Редактор Т. Лазоренко Техред М.Ходанич Корректор Л.Патай

Заказ 191 Тираж 487 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьггиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðoä, ул. Гагарина, 101 фрагмент гена 1ас, соединенный с синтетическим полилинкером, расположенный по обе стороны клонированной

ДНК плазмиды Р4; гены рестриктазы и метилазы БзоХТ, расположенные на клонированной ДИК плазмиды Р4, фланкированной сайтами

SalGl, детерминирунщие синтез рестриктазы и метилаэы SsoII.

2. Штамм бактерий Fscherichia

4 со11 ГИСК-178 — продуцент рестриктазы и метилазы SsoII.