Штамм бактерий кlевsiеllа рnеuмоniае, используемый в качестве референс-штамма при определении антилизоцимной активности бактерий, и способ определения антилизоцимной активности бактерий

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для прогнозирования реконвалесцентного бактерионосительства. Цель изобретения - ускорение способа и повышение точности при количественной оценке антилизацимной активности. Штамм KLEBSIELLA PNEUMONIAC выделен из объектов окружающей среды и депонирован под номером ГИСК N 151. Штамм несет плазмиду PAL<SB POS="POST">T</SB>-60, кодирующую синтез антилизоцимного фактора. Штамм инактивирует 20 мкг/мл лизоцима, показатель антилизоцимной активности А = 0,98. Референс-штамм N 151 и исследуемую культуру раздельно выращивают в жидкой питательной среде, затем смешивают с раствором лизоцима и суспензий MICROCOCCUS LUSODEIKTUCUS. Полученные смеси выдерживают в течение 25 - 30 мин. и измеряют оптическую плотность при длине волны 400±200 нм. Активность антилизоцимного фактора прямо пропорциональна оптической плотности. Показатель А исследуемой культуры определяют по формуле, сравнивают с показателями А референс-штамма и определяют концентрацию лизоцима, которую способна инактивировать исследуемая культура. 2 с.п. ф-лы.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

O% <И1

А1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ HGMHTET по изОБРетениям и ОТКРытиям

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4417850/31-13 (22) 27.04.88 (46) 23.01.90. Бюл. У 3 (71) Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. почет. акад.Н.Ф. Гамалеи (72) В.M. Бондаренко, А.Л. Яблочков и В.Г. Петровская (53) 576.8.093. 1.(088.8) (56) Бухарин О.В. и др. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов. — ЖМЗИ, 1984, 11 - 2, 27-28. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ К?.ЕВЯТЕЬ? А PNEUH0NIAE, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ РЕФЕРЕНС-ШТАММА ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ, И СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ БАКТЕРИЙ (57) Изобретение относится k медицин1 ской микробиологии и может быть использовано для прогнозирования реконвалесцентного бактерионосительства.

Цель изобретения — ускорение способа и повышение точности при количественИзобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано для прогнозирования реконвалесцентного бактерионосительства.

Цель изобретения — ускорение способа и повышение точности при количественной оценке антилиэоцимной активности.

Штамм Klebsiella pneumoniae АВ-86 отобран из коллекции культур клебсиелл, выделенных при внутрибольничной инфекции новорожденных. Штамм депони (51)5 С 12 N 15/00, С 12 q 1/00// (С 12 N 15/00, С 12 R 1-22) 2 ной оценке антилизацимной активности.

Штамм Klebsiella pneumoniae выделен из объектов окружающей среды и депонирован под номером ГИСК Ф 151. Штамм несет плазмиду рА1 -60, кодирующую синтез антилизоцимного фактора. Штамм инактивирует 20 мкг/мл лизоцима, показатель антилизоцимной активности

А = 0,98. Референс-штамм У 151 и исследуемую культуру раздельно выращивают в жидкой питательной среде, затем смешивают с раствором лизоцима и суспензий М1сrocwccus lysodeiktucus.

Полученные смеси выдерживают в тече ние 25-30 мин и измеряют оптическую ппотность при длине волны 400+20 нм. Я

Активность антилизоцимного фактора прямо пропорциональна оптической плотности. Показатель А исследуемой культуры определяют по формуле, сравнивают с показателями А референсштамма и определяют концентрацию лизоцима, которую способна инактивировать исследуемая культура. 2 с.п.ф-лы. рован под номером ГИСК Р 151 и харак теризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки прямые, неподвижные, обладают хорошо выраженной капсулой, палочковидной формы размером 0,3х1,5х х6,0 мк, одиночные, в парах или корот.ких цепочках.

При росте на МПА образует колонии гладкие, круглые, выпуклые, блестящие, консистенция слизистая. При рос1537689 те в жидких питательных средах образует равномерную муть.

Физиолого-биохимические признаки.

Прототроф иа минимальной среде с глюкозой растет в пределах 4-45 С.

B качестве единственного источника углерода, кроме глюкозы, может использовать цитраты, мукаты, малонаты, фруктозу, галактоэу, арабиноэу, лак- 10

; тозу, сорбит и дульцит. Обладает уреазной и лизин-декарбоксилазной . активностью. Восстанавливает нитраты, :до нитритов. Обусловливает положитель; ную реакцию Фогес-Проскауэра. Желати- 15 ну не разжижает. Гемолизина не образует.

Устойчивость к антибиотикам.

Бактерии устойчивы к канамицину (50 мкг/мл), ампициллину (500 мкг/мл), 20 хлорамфениколу (50 мкг/мл) и сульфаниламидам (50 мкг/мл).

Антилизоцимная активность. . Инактивируют 20 мкг/мл лизоцима, показатель А = 0,98. 25

Стабильность антилизоцимного признака. При выращивании бактерии на

МПА, содержащим 50 мкг/мл канамицина или 5000 мкг/мл ампициллина, или

50 мкг/мл хлорамфеникола, получают микробные клетки, характеризующиеся высокой антилизоцимной активностью.

Это связано с тем, что гены, контролирующие антибиотикоустойчивость и синтез антилизоцимного фактора, локализованы на одном репликоне плазмиды рА1 -60.

Рестрикция плазмиды рА1. -60, кодирующей синтез антилизоцимного фактора, показала, что данная плазмида 40 имеет один сайт узнавания для рестриктаз EcoR 1 и Xho 1,16 — для Nsp 1;

17 — KpN 1; 18 — Bglll и 20 — для эндонуклеазы Hind III Для контроля наличия у бактерий референс штамма

К.pneumoniae АВ-86 плаэмиды рА1 -60 следует определить сохранение микробными клетками устойчивости к указанным антимикробным веществам, поскольку детерминанты резистентности нахо50 дятся на этом же плазмидном репликоне вместе с генами, детерминирующими антилизоцимную активность.

Способ осуществляют следующим образом.

Референс-штамм и испытуемые бактериальные культуры выращивают раздельно в минимальной среде при шуттелировании, отделяют культуральную жилкость от клеток центрифугированнем.

Надосадочную жидкость смешивают с суспензией клеток микрококка и раствором лизоцима. Выдерживают при комнатной температуре в течение 25-30 мин и измеряют оптическую плотность при длине волны 400+20 нм.

Активность антилизоцимного фактора прямо пропорциональна оптической плотности. В качестве контролей используют смеси: беэ лизоцима (К )

1 ее оптическую плотность принимают за плотность образца с полным подавлением действия лизоцима; без культуральной жидкости (замененной стерильной минимальной средой) - после 30 мин инкубации при комнатной температуре (K ) этот контроль соответствует пол2 ному отсутствию антилизоцнмной активности (полное просветление).

Антилизоцимную активность (А) культуральной жидкости исследуемого штамма рассчитывают по формуле (с точностью до второго знака) Ио

К вЂ” К

Я где М вЂ” оптическая плотность опытной смеси;

К< и К вЂ” оптические плотности перво 2

ro и второго контролей.

Показатели А, равные 0,3 и выше, считаются положительными при учете антилизоцимной активности как эпидмаркера изучаемого штамма, Показатели, равные и выше 0,7, позволяют отнести выделенный штамм к штаммам-бактериям, способным к длительному переживанию в условиях организма хозяина, связанному с процессом реконвалесцентного бактерионосительства.

Пример. Референс штамм

Klebsie1la pneumoniae АВ-86, несущий плазмиду pAL -60, контролирующую синтез антилизоцимного фактора, выращивают в минимальной среде М9, содержащей на 1 л, Е: Na >HPO< 6, О; КН РО

3,0; ЙН1С1 1,0; NaC1 0,5; глюкоза 1, рН 7,2-7,0.. Для ауксотрофных штаммов применяют добавки в стандартных концентрациях: аминокислоты 20 мкг/мл и витамины 1 мкг/мл. Иожно испольэовать среду I B содержащую на 1 л

Bacto-tryptou 10,0 r, дрожжевой экстракт 5,0 г, и NaC1 10,0 r. Бактерии, о, выращенные при 37 С в течение 18 ч

89 6 на наличие антилизоцимной активности в соответствии с указанной выше методикой тестирования (прнмер).

При этом получены следующие показатели Мо О, 35»,K o 35, = 20, А = О.

Все штаммы Е.coli К-12 дают отрицательные показатели антилизоцимной активности.

Исиольsosание способа и нового референс-штамма позволяет ускорить способ (1 сут вместо 48-72 ч) и повысить точность количественного определения антилизоцимной активности бактерий.

Формула изобрегения

Мо К2

К вЂ” К равный 0,98. зий °

Составитель Г. Смирнова

Техред М.Дндык Корректор О. Кравцова

Редактор H. Рогулич

Заказ 145 Тираж 487 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

15376 (при шуттелировании 200 качаний/мин время можно сократить до 10 ч), осаж дают центрифугированием при 4000 об/мин в течение 20 мин. Взвесь клеточных стенок М.lysodeiktieus готовят из5 .вестным способом. Можно использовать суспензию живых бактериальных клеток микрококка, выращенных в течение

18 ч, на 1,5Х мясопептонном агаре с 1Х-ной глюкозой, содержащей в 1 мл

1х107 микробных тел. Готовят рабочий раствор лизоцима, содержащего

100 мкг/мл препарата, в физиологическом растворе хлористого натрия:

Объемное соотношение культуральной жидкости, суспензии микрококка и раствора лизоцима составляет

10:5*.1. Смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 25-30 мин 20 и измеряют оптическую плотность при длине волны 400+20 нм.

Получают следующие показатели:

Мо = 0,94; К, = 0,95; К = 0,21.

Производят расчет по формуле 25

Штампы, выделенные при внутриболь ничной инфекции, характеризуются различной степенью антилизоцимной активности.

Штамм K.pneumoniae АВ-86 обладает наиболее выраженной антилиэоцимной активностью (А = 0,98), которая прн использовании метода раститровки соответствует инактивации 20 мкг/мл лизоцима.

Лабораторные штаммы E.coli К, могут быть использованы в качестве отрицательного контроля. Бактерии выращивают как описано в примере» и культуральную жидкость проверяют

1. Штамм бактерий Klebsiella

pneumoniae ГИСК Ф 151, используемый в качестве референс-штамма при определении антилизоцимной активности бактерий.

2. Способ определения антилизоцимной активности бактерий, включающий посев и выращивание исследуемой культуры в присутствии лизоцима и тесткультуры Nicrococcus lys odeiktucus и учет полученных результатов, о тличающийся тем, что, с целью ускорения способа н повышения точности при количественной оценке антилизоцимной активности, осуществляют раздельное выращивание исследуемой культуры и референс-штамма Klebsiella pneumoniae ГИСК У- 151 в жидких питательных средах, отделяют супернатант и инкубируют последние с суспензией тест-культуры и лизоцимом в течение 25-30 мин, а антилизоцнмную активность определяют по оптической плотности инкубированных суспен