Способ контроля процесса культивирования микроорганизмов

 

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности, а также к тем областям, где необходимо экспрессное определение таксономической принадлежности микроорганизмов. Цель изобретения - ускорение процесса и повышение его надежности. Способ заключается в том, что отбирают пробы, содержащие микробные клетки, разделяют их на несколько частей и добавляют в качестве субстрата соли тетразолия - тетранитросиний тетразолий хлористый, м - нитронеотетразолий фиолетовый, тетразолий фиолетовый, 4-нитросиний тетразолий хлорид, неотетразолий хлорид, тетразолий фиолетовый бромид, метилтиазолилтетразолий бромид, регистрируют интенсивность окраски любыми методами, определяя активность дегидрогеназ. По соотношению дегидрогеназных активностей определяют таксономическую принадлежность микроорганизмов. 12 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

РЕСПУБЛИК (191 (И) А1 (51) 5 С 12 Q 1/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H A ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ и участвуют в цикле трикарбоновых кислот и системе переноса электронов, т. е . присущи в сем клеткам и являются жизненно важной частью живой клетки, Их активность значительно вьппе, чем активность аминопептидаэ. Они намно. го меньше подвергаются воздействиям извне, чем аминопептидаэы. Растворы солей тетразолия являются бесцветны ми прозрачными жидкостями. Они r.осстанавливаются дегидрогеназами в местах их локализации (митохондрии, мезосомы) до формазана — оптически плотного соединения. В этом случае происходит окрашивание суспензии клеток.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4453230/30-1 3 (22) 01.07.88 (46) 15.05.90. Бюл. - 18 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биологического приборостроения (72) С.В. Газенко и Н.И. Королев (53) 663.18 (088.8) (56) Юровская Е.M. Дегидрогеназная активность бактерий, как тест для оценки токсичности химических веществ. — Гигиена и санитария, 1977, 12, с. 69-72.

Coburn I.Т., Zytle F.Е., Huber D.М. — Anal chem 1985, 57, р. 1669-1673. (54) СПОСОБ КОНТРОЛЯ ПРОЦЕССА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности, l

Изобретение относится к биотехнологии, пищевой промышленности, а также к тем областям, где требуется экспрессное определение таксономической принадлежности микроорганизмов.

Целью изобретения является ускорение процесса и повышение его надежности, Способ заключается в том, что в качестве исследуемой группы ферментов используют дегидрогеназы, а в качестве индикаторов дегидрогеназной активности соли тетразолия.

Дегидрогеназы являются конститу» тивными внутриклеточными ферментами а также к тем областям, где необхо-— димо экспрессное определение таксономической принадлежности микроорганизмов. Цель изобретения — ускорение процесса и повьппение его надежности.

Способ заключается в том, что отбирают пробы, содержащие микробные клетки, разделяют их на несколько частей и добавляют в качестве субстрата соли тетраэолия — те"гранитросиний тетраэолий хлористый, м-нитронеотетраэолий,фиолетовьп, тетразолий фиолетовый, 4-яитросиний тетраэолий хлорид, неотетраэолий хлорид, тетраэолий фиолетовый бромид, метилтиазолилтетразолий бромид, регистрируют интенсивность окраски любыми методами, определяя активность дегидрогеназ.

По соотношению дегидрогенаэных активностей определяют таксономическую принадлежность микроорганизмов. 12 ил.

1564193

Тетразолии обладают различными „, окислительно-восстановительными потенциалами, проницаемостью сквозь клеточную оболочку и токсичиостью в отношении различных клеток. Коли5 чество и активность дегидрогеназ с определенным окислительно-восстановительным потенциалом также различаются у групп и видов микроорганизмов. 0

Для определения профиля, например, чистой суспензии микроорганизмов необходимо разделить ее на несколько частей и к каждой добавить раствор соответствующей соли тетразолия. Пос- 15 ле инкубации клеток с красителями в каждой пробе развивается окрашивание.

Измерение степени окрашивания на

ФЭКе, спектрофотометре или визуальное сравнение позволяет делать вывод о таксономической принадлежности исследуемых клеток.

На фиг.1-12 представлены дегидрогеназные профили микроорганизмов.

Профили различных видов значитель- 25 но отличаются друг от друга. Профили родственных: видов более близким (Е, coli M-17, Serratia marcescens), но и им присущи за,етные отличия.

Некоторые клетки отличаются своей общей низкой (Torula latvica, Pseudomonas, aurautica,ôèáðoáëàcòû) или высокой (род Bacillus) дегидрогеназной активностью. При этом профиль может быть представлен как в процентах

35 (за 100Е принимается наиболее интенсивно окрашенная проба) так и в виде отношений интенсивностей окраски. В этом случае профиль, например, принимает вид: 0,71: 0,16: 0,05: 0,06: о 0 7 1 0 1 0 0 9 1 Ô

Дегидрогеназные профили микроорганизмов могут быть использованы для экспрессного .анализа колоний микроорганизмов после подроста на питатель- 5 ных средах на стадиях контроля исходного сырья и качества готовой продукции. Создание банка профилей на те или иные микроорганизмы позволяет судить о загрязнении выращиваемой куль50 туры микроорганизмов в ферментере посторонней микрофлорой и делать вывод о ее таксономической принадлежности.

Для оптимальной переработки ис55 ходного сырья часто используют консорциумы двух-трех видов микроорганизмов.. Постоянныйконтроль их соотно. шения в процессе ферментации необхо-; дим для производства высококачественной продукции. Определив профили этих видов и выявив те красители, которые окпашивают клетки одного вида и не окрашивают клетки другого вида, можно дифференцировать их и определять количество тех и других с помощью обычного микроскопа. Аналогично можно дифференцировать под микроскопом культивируемые клетки и постороннюю микрофлору.

Определение. э талонного профиля.

Готовят несколько пробирок, содержащих равные по объему (1 мл) и концентрации клетки Е.cali М-!7 (108кл/мл), выращенные на МПА при

37 С и суспендированные в фосфатном буфере (рН 8,2). В каждую пробирку добавляют по 0,2 мл спиртового раствора соответствующей соли тетразолия (концентрация 1 мг/мл). Пробирки инкубируют 10 мин при 37 С на водяной бане. Затем в каждую добавляют последовательно 1 мл 10Х-ного формальдегида в воде и 1 мл этанола.

Полученные пробы фотометрируют. Рекомендуемая абсорбции света 575 нм.

Полученные величины поглощения представляют собой специфический профиль вида.

Используемые соли тетразолия (графики:):

1. Тетранитросиний тетразолий хлористый С 4о Н г Н 1 0 оС1

2. м-Нитронеотетразолий фиолетовый С Ны1 1 О (-1

3. Тетразолий фиолетовый Ст Н„711 С1.

4. Тетразолий синий С4 HggC1 gNgOg.

5. 4-Нитросиний тетразолий хлорид

С оН зоN „оО С1 г, 6, Неотетразолий хлорид С. Н 11 Сl

7. Тетразолий фиолетовый бромид

С Ф пБ™

8. Метилтиазолилтетразолий бромид

С Н В .

Пример 1, В процессе производства пивных дрожжей (Sacch,earls

bergeusis)Mover происходить загрязнение дрожжей бактериальной микрофлорой, в том числе и такой, которая с трудом определяется при микроскопировании или сравнима с дрожжами по морфологии, Для дифференциации живых бактериальных клеток от дрожжей под микроскопом составляют дегидрогеназные профили пивных дрожжей и посторонней бактериальной микрофчоры (согласно

64193 6

40 Формула изобретения

1. Способ контроля процесса культивирования микроорганизмов,предусматривающий отбор проб, содержащих микробные клетки, определение в них ферментативной активности путем добавления специфических субстратов с последующим определением таксономической принадлежности микроорганизмов по соотношению активности ферментов одной группы, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью ускорения процесса и повышения его надежности, определяют дегидрогеназную активность микробных клеток,при этом

55 в качестве специфических субстратов используют соли тетразолия, а определение таксономической принадлежности проводят по соотйошению дегпдрогеназных активностей.

5 15 методике определения эталонных профилей), При рассмотрении полученных профилей обнаруживается, что все бактвриальные формы интенсивно окрашиваются метилтеазолилтетразолием бромистым (ИТТ ), У 8 на фиг.1-3, 5-8).

Клетки Sacch. earls bergeusis практически не окрашиваются этим красителем. Следовательно, при добавлении

МТТ в инкубационную среду интенсивно окрасятся лишь живые бактериальные клетки, которые могут быть подсчитаны под микроскопом с помощью камеры Горяева. В поле зрения микроскопа окрашенные живые клетки хорошо отличимы от неокрашенных частиц.

Количество живых же клеток пивных дрожжей определяют путем восстановления или тетранитросинего тетразолия хлористого.

Сходным образом может быть обнаружено бактериальное загрязнение фибробластов, используемых в производстве вирусных препаратов, загрязнение дрожжами других видов хлебных, пивных, кормовых дрожжей и т.д.

Пример 2. Для производства микробного белка часто используют консорциумы дрожжей различных таксономических групп, в частности виды родов Saccharomyces H Candida. Многие виды этих групп ярко отличаются по способности восстанавливать раз-, личные тетразолии. Составление профилей указанных микроорганизмов (по приведенной методике) показывает что

Saccharomyces эффективно окрашиваются формазанами тетранитротетразолия хлористого и 4-нитросинего тетразолия хлористого, Candida окрашиваются неотетразолием хлористым, п-нитротетразолием фиолетовым и 4-нитросиним тетразолием хлористым, Таким образом, с целью поддержания оптимального соотношения этих клеток в процессе производства белка целе-— сообразно для определения Candida в смеси использовать при микроскопировании п-нитротетразолий фиолетовый .или неотетразолий хлористый, à Saccharomyces — тетранитротетразолий хлористый; для определения общего количества живых клеток — 4-нитросиний тетразолий хлористый — окрашивающий .как те,. так и другие клетки, Аналогичным образом могут быть выбраны (после определения профилей) тетраэолии, избирательно окрашивающие

35 клетки в с става слаяннх заквосск, используемых для приготовления т",ог >га, сметаны, сыра и т.д. (S.lactis H

S.cremoris, S.lactis H S.thermophilus, L. bulgaricus H L.acidophilus). При отсутстви.*. четких избирательно окрашивающих красителей возможно фотометрирование смесей клеток с тетразолиями, дающими различные интенсивные окрашивания. Этим же способом целесообразно выявление определенных санитарно-значимых и патогенных микроорганизмов в молочной .продукции.

Способ может быть реализован в зависимости от конкретных требований производства при использовании двух и более солей тетразолия.

Для регистрации образовавшегося в клетках формазана могут быть использованы различные фотометры, спектрофотометры, нефелометры, фотоэлектроколориметры. Наблюдение и сравнение профилей и их элементов (использование определенных красителей ня отдельные группы и виды клеток ) может проводиться визуально и при микроскопировании.

Предлагаемый способ отличается высокой экспрессностью, надежностью получаемого результа-а, экономичностью и простотой в исполнении.

Для осуществления может быть использовано большое количество (более 30) дешевых и устойчивых в хранении красителей, не требующих отмывки и другой обработки пробы.

1564193

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве солей тетразолия используют тетранитросиний тетразолий хлористый, м-нитронеотетразолий фиолетовый, тетразолий фиолетовый, тетразолий синий, 4-нитросиний тетразолий хлорид, неотетразолий хлорид, тетразолий фиолетовый бромид, метилтиазолилтетразолий бромид.

1564193

1564 193

Составитель В. Голимбет

Те<ред Л.Олийнык КоРРектоР А. Обручар Редактор Т. Лазоренко

Заказ 1139 Тираж 483 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101