Способ выявления возбудителя чумы

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (1!), ОПИОЛНИК ИЗОБРКТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР (46) 15.0?.9?. Бюл. ¹ 6 (21) 4442300/13 (22) 17.06,88 (71) Всесоюзный научно-исследовательский противочумный институт "Микроб". (72) H. Н. Суриков, A.Ô. Касьян, А.Ю. Пашин, А.И. Кологоров и H.Ã. Пономарев (53) 576.8.078(088.8) (56) Наставление по применению иммуноглобулийов диагностических чумных люминесцирующих сухих, Саратов, 1982. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ .чу?"ы (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть ис.пользовано при микробиологической диагностике чумы и других особо опасИзобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для диагностики чумы.

Целью изобретения является ускорение и повышение чувствительности способа.

Пример 1. В центрифужную пробирку объемом 11 мл добавляют последовательно 1 мл 1007 глицерина рН 7,2-?,4 окрашенного каким-либо красителем (метилвиолет, конгорот и т,д.), наслаивают 0,5-1 мл эабуференного 807 глицерина рН 7,2-7,6, добавляют 5 мл исследуемой пробы, подозрительной на зараженность бактериями чумЫ, в которую преднарительно вносят чумные диагностические люмннесцирующие иммуноглобулинь1 до рабочей концентрации, которая соотнетстн>ет 1:50 для нммуноглобу .;tttr. в с рабочим тит(51) 5 С 2 1/04 G Ol N 33/53 ных инфекций. Целью изобретения является ускорение и повышение чувствительности способа. При исследовании объектов внешней среды на наличие возбудителя чумы применяется центрифугирование в градиенте плотности глицерина. Пробы предварительно обрабатывают специфической люминесцирующей сывороткой; В результате чего достигается концентрация микробов в объеме 80Х глицерина с одновременной окраской их люминесцирующими иммуноглобулинами. Посторонние частицы, имеющие плавучую плотность большую по сравнению с плотностью возбудителя чумы оседают на дно центрифужной npo-.t бирки. 3 табл. ром 1: 8 (pJIR иммуно глобулинов с титром 1:16 и 1:32 рабочая концентрации соответствует разведению 1:100, а для иммуноглобулинов с титром !:64 рабочей концентрацией является разведение 1:150). Затем пробу инкубируют при комнатной температуре в течение

3-5 мин и центрифугируют 10 мин на центрифуге с ротором диаметром 180 мм при 5000 об/мин (2500 g), После центрифугирования четко разграничиваются три слоя: верхний

5 мл надосадочной жидкости; средний — 0,5-1 мл эабуф<"ренцого 802 глицерина, который содержит микроб ые клетки и нижний — 1 мл 100Л глицерина с посторонними частицами (з< млн, песок, пыль и т.д.). Для дальнейшего исследонанил с помощью пипетки П tc.repa, шприца !%ltt tlt гом tTt, есгсй пц1549077

Из представленных результатов следует, что способ является более эффективным по сравнению с общепринятым при ускоренной диагностике возбудителя чумы, т.к. среднее число светящихся бактерий, выращенных при

37 С в 10 полях зрения при общепри- " нятом методе исследования составляет 2 0 3 при исходной концентрации !

0 м.кл. результат отрицательный. !

При разработанном методе число светящихся микробных клеток составляет

14+3 и 2 0,2, соответственно, что в

7 раэ эффектнее.

Среднее число светящихся бактерий, выращенных при 28 С в 10 полях зрения при исследовании разработанным методом составляет 1,2+0,2 и !2+! при исходной концентрации микробов т 8

10 и 10 м.кл, в 1 мл соответственно, а при исследовании общепринятым методом результат отрицательный.

50 петки отбирают средний слой 0 5-! мл забуференного 80Х глицерина, содержащий микробные клетки и помещают н стерильную пробирку. Затем из этой пробы отбирают материал для посева на питательные среды, для эаражепия лабораторных животных и петлей Ф 2 де лают мазки на обезжиренном предметном стекле. 11азки закрывают покровиым стеклом, на края которого наносят расплавленный парафин таким образом, чтобы образовалась герметическая камера, помещают в крышку чашки Петри и просматривают под люминесцентным микроскопом, отмечая количество микробных клеток и степень специфического свечения. От начала до конца исследования занимает 16-18 мин.

Пример 2 ° Способ ускоренного выявления возбудителя чумы апробирован в следующих условиях: в 2 чашки Петри помещают садовую землю (2 r), затем в каждую вносят по 5 мп взвеси Jersinia pestis в физиологи- 25 ческом растворе концентрацией !0 и

10. м.кл. в 1 кп. Культуру выращива8 ют на агаре Хоттингера в течение

48 ч при 28 и 37 С.

Чашки помещают в термостат при о28 С до полного высыхания. Загем с чашек делают смыв 10 мл забуференного физ. раствора рН 7,2-7,4. Всего проведено 10 опытов. Результаты (сводные данные по 10 опытам) представлены в табл. 1.

Пример 3. Проведено испытание активности, чувствительности и специфичности способа в сравнении с традиционным методом флуоресцирующих антител.

Результаты испытания активности и чувствительности представлены в табл. 2; специфичности в табл. 3.

Установлено, что предложенный метод по своей ВКТНВНосТН превосходит традиционный метод, т.к. при его применении интенсивность свечения клеток штамма J. pestis E.Â. как выращенного при 28 С, так и при 37 С, а также сухой вакцины ЕВ возрастают на эдин порядок.

Чувствительность заявленного метода при исследовании минимальных концентраций (I ° !0 м.кл. в мл) микробных клеток штамма J. pestis ЕВ, выращенных при 28 С и 37 С в 3 раза выше, чем у общепринятого метода {cM> табл. 2). Специфичность заявленного метода исследована с помощью возбудителя псевдотуберкулеза (шесть эталонных штаммов серотип в I II ХХТ, IV, V, VI) и кишечного иерсиниоэа (штаммы — 97,3733 в концентрациях ! 1О ; 1.10 - 5 10 и 5 "10 м.кл. в мл °

Установлено, что при изучении специфичности заявленного и общепринятого способов заметного расхождения результатов не отмечено {c». табл. 3).

Предлагаемый способ по своей активности и чувствительности превосходит общепринятый метод флуоресцирующих антител, не отличаясь от него по своей специфичности. Способ может быть использован с целью индикации возбудителя чумы в смывах с объектов внешней среды.

Формула и з о б р е т е н и я

Способ выявления возбудителя чумы, включающий центрифугнрование исследуемого материала, приготовление мазка, обработку специфическими люминесцирующими иммуноглобулинамн с последующей микроскопией, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью ускорения н повьппения чувствительности способа, перед центрнфугированием люминесцирующие иммуноглобулины вносят в исследуемый материал, центрифугирование полученной смеси осуществляют в градиенте плотности глицерина, а для приготовления мазка используют слой 802 глицерина. с

1549077

Таблица 1

Общепринятый метод Предлагаемый метод выращивания чумного микроба, С

Температура

Г 1

28 37 28

Количество микробных клеток в lО полях зрения (среднее арифметич,) и интексивность свечения т

1 -lO

2йО, 2 . (+++)

О 4+3 (+++)

1, 2 +О, 2 (+++) !

2И (+++) ! ° 100

2+О, 3

Еонпемтрапи1 t npe ба, м.кл./

/мл таблмне2

Обнепрммиееед Ma Tnn l.

Предлатаемеме метод

ReNN/TeNnepeType амранизаник С

Пример

aonN%ecTeo nspNNa Na2aoe

F Т T Т Т Г 1

«ааа ааааа а а

1 J. pestis.ЕЬ/28 1.10

Фб+ 4+4 бб+

Фб

ФФФ и кл з моле эренн °

Фб+ ФФФ б Фб

8 м.кл. ° поле эоамми

+ ° ФФ ФФ+Ф ФФ Фб еаинич.

Ф+ еамнэие, 444

1 ° 10

2 J. pestis ЕЬ/28

3 J. pattie K8/2Ь

ФФФФ елииич.

+б+ Фбб едим ми °, Ф Ф+ Ф

+444

44+ болевое

+Фбб количества е пола эреииа

ФбФ+ +Фб б ФФ б

6 и,кл. а попе еремии

ФФФФ 4444 +ФФФ 4+4 б

-I4 и. кл a nona еремии

ФФФ ° ФФФб +444 +бФб количестэо ° ноле зрении бб

4 . J. pestfe ЕЬ/37 1 10 аднмнЧ

1 1О 44 еаииич.

4+44 44 °

2 и.кл. 8 и.кл

4+4 ФФФ 5 J. pestis ЕЬ/37

ФФФ б б+ едммнч. 2 ик.л

ФФФ ФФФ едммнч

+ФФФ балзное

6 J, petti ° ЕЬ/37

7 Стнаи эекпима еь

5 10 количестмо ° пола еремин

ФФФ 4+Ф +бб

-8 и.кл е попа зраннл

Ф+ФФ ++Ф Фб+

-20 м.кл ° поле зреимн колнчестэо м.кл

+4

2 и.кл

+б м.кл 6 м.кл э поле эркима

l 10 ббб

7 м.кл

1 107

8 "-"-K8

cNNe

9 J. pattie ЕЬ/2Ь баб Ф б+ Фбб

1 10

ФФ+

+Ф

Фбб еаннмчнма н.an э лала эреиик бб ФФФ ++ ФФФ

4 - 5 N,an э пале зрении +++ ° Ф 4+ 4+4

10 J< petti ° ЕЬ/28 . l IO бб

ll J. pestis ЕВ/37 I 10 бббб

Ф+44

+44 епимнчнме н. кл ° пале еремин

Фббб 4444 4444 Ф++Ф

3-5 м.кл э пале зрение

12 Csese 88/37

J. peetis

1 ° 10

ФФФФ

Концентрация микробных хле ток в пробе (м кл, в мл объем 5 ип) Фбб+

2 бббб

Ф+бб болзюе

444 Ф

++44

Фбб+ больное

+бб

+Ф+Ф

4 а

+бб+ +4+. Фб Ф 44+4

2 - 4 и.кл ° поле зрении

+ббб бФ4 4б ° + +44+

10 - 13 н.кл а поле зрении

4+44 4444 Фббб 444+

2-3 м.an э поле зрение

ФФФ+ ФФФФ 4444 ббб+

10-12 м.кл э поле еремии

) 549077! 111! !

1 1 I 1 1 I I I 1 I

I I 1 I

I I I 1 й

1 1

1 1 1

1 1 I 1 !

1 I ! 1 I I

° . °

М Б

+ !)

+ + Ф + в °

1 1 1 1 1 1 1 I 1 ! I 1 1 I . I I I 1

1 t 1 1 1 I I I

1 1 I I

1 1!

1,1

) 1 I I 1 I 1

+ 1

1 1 I"! +л 1 1 1

I ) I

1 1 1. I 1 1 1 ° 1 ° I ° 1 ° 1 I

П .,5 6 5

i я 3

I I I +64 I l + 6+ О+ +.

3! l I 1

I I

1.1 1 1 1 1

° g 1 1 е е

0 мЪН111 о ОЪ о

Е C Е

О О О

1 . I I и й

1 1 1 ф е е ее ° °

° ° °

° е ю»М\МЪ

1 1 1 е

I 1 I е ° °

° ° е ° ф/Ъ

Ф CO

C»I c»C е»»»

CO

CO И

ФeV в»)WH М Н

HHH

Ф л л )ч ci

И л

О 0%

ЛФФ л Ф

Я 4»е C»C A в). ллл а

Я МЪ Ccl

ЛФФЛ

W И. С»С е1Ъ » » юе ею ° Л л л л мъ

С0

C»I

Н . Вэ и

Р )!

Ю

° О ЪМ 1

I 1 1 1 1 и й Ф Ф

1 1 1 I I

I ) 1 I и 0 и 3 е

I. 1 l 1 1

° CV веЪ»Ф A Ф в Ф Ф О

О е ° C»I C»»1 ф Ih. вО Л Ф g\ ее

I I!

В 6 в$ вй

1,1 11+O I ° 11 1+t411+

0 4 1е 1Ô

)е Q 4) О эauм ии)!и

g.) ел . Щ в4 гМ

° 0 ° 0 р 0 Q CJ

С0

4М 4 )

4»Ъ )вЪ л л

1»Ъ Фе\

1 I

О О

C) S O 5

u -w u. )

gu gu

° 0 ° О

1) U Ъ C)