Способ получения биологически активных мукополисахаридов

 

Изобретение относится к способу получения биологически активных мукополисахаридов, применяемых в медицине. Целью изобретения является варьирование терапевтического профиля мукополисахаридов. Эта цель достигается способом, заключающимся в деполимеризации гепарина под действием нитрита натрия в водном растворе при концентрации гепарина 5 мас.% и нитрита натрия - 0,0435 М, при PH 2,5 до полного отсутствия ионов NO<SB POS="POST">2</SB>, перед выделением целевого продукта доводят PH до 7, вводят этанол и выделившийся осадок растворяют в водном растворе хлористого натрия при PH 3, 8, а выделение целевого продукта проводят при объемном соотношении этанола и реакционной смеси 1:1. 4 ил., 1 табл.

„„SU„„1570651

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н IlATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

r1Q ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 3965564/23-05 (22) 17.05.85 (31 ) 841 5978 (32) 18.10.84 (33) FR (46) 07. 06. 90. Бюл. Р 21 (71) Хоай С,А. (FR) (72) Жан-Клод Лормо и Жан Жоай (FR) (53) 547.995.17(088.8) (56) Патент СССР Ф 1209033, кл. С 08 В 37/10, 1979. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ

АКТИВНЫХ МУКОПОЛИСАХАРИДОВ (57) Изобретение относится к способу получения биологически активных мукополисахаридов, применяемых в медициИзобретение относится к способу получения мукополисахаридов (МПС), обладающих антитромболитической активностью, и может быть использовано в медицине для предупреждения и лечения тромбозов и старения тканей, а также в лабораторных исследованиях.

Целью изобретения является варьирование терапевтического профиля биологически активных мукополисахаридов .

П р н м е р 1. 500 г годного для инъекции гепарина в виде соли натрия. растворяют в 4500 мл деминералиэоо ванной воды при 18 С. Соотношение титров IW=/ v SP используемого гепарина близко 1, эти титры имеют значение порядка 160-170. (51)5 С 08 В 37/10 // А 61 К 37/18

2 не, Целью изобретения является варьи рование терапевтического профиля мукополисахаридов. Эта цель достигается способом, заключающимся в деполимериэации гепарина под действием нитрата натрия в водном растворе при концентрации гепарина 5 мас.Х и нитрита натрия — 0,0435 М при рН 2,5 до полного отсутствия ионов

N0 перед выделением целевого продукта доводят рН до 7, вводят, этанол и выделившийся осадок растворяют в водном растворе хлористого натрия при рН 3,8, а выцелением целевого продукта проводят при объемном соотношении этанола и реакционной смеси

1:1. 4 ил., 1 табл, Полученный раствор энергично перемешивают, à его величину рН снижают до 2,5 путем добавления концентрированной хлористо-водородной кислоты, Затем добавляют 15 г нитрита натрия, растворенного в 300 r воды. Величину рН регулируют до 2,5 путем добавления хлористо-водородной кислоты, и общий объем доводится до

5000 мл. Дают реакции проходить в

I течение 45 мин, затем проверяют отсутствие остаточных азотистых ионов в реакционном растворе с помощью индикаторной бумаги, пропитанной йодистым калием с крахмалом (появление сине-фиолетовой окраски в присутствии ионов N02).

Продолжают реакцию до полного исчезновения нитрита и до отсутствия

1570651 отношение этанол . реакционная смесь 2:1. Через 48 ч отстаивания продукт сцеживают и удаляют всплывшую часть. Осадок вновь растворяют в 9 л деминерализованной воды. Добавляют 1 00 г хлористого натрия и повышают величину рН раствора до 3,8 с помощью концентрированной хлористоводородной кислоты. Объем доводят .,точно до 1 0 л, добавляя деминерализованную воду, и при энергичном перемешивании добавляют 1 0 л этанола.

Оставляют отстаиваться в течение

48 ч. Всплывшую часть сифонируют и удаляют. Осадок извлекают, промывают этанолом, измельчают и cóøàò в вакууме.

Получают 230 г продукта со следующими харак теристиками: титр @

VSP 52 E/Mã; титр Йин и Весслер (IW)

225 Е/мг; средняя молекулярная масса»4000-5000 дальтон; IW/ЧЯР 4,3.

Пример 2, Способ получения фракций, имеющих, титр IW u VSP в со- 45 отношении 4,3.

5000 r годного для инъекции гепарина растворяют в 45 л-деминерали0 зованной воды при 18 С. Деиствуют

ЯQ подобным примеру 1 образом, умножая количество реактивов на. 1 О, т.е. добавляют 1 50 г азотистого натрия в

3 л воды; доводят объем реакционной смеси до 50 л; добавляют 50 г тетра<5 гидридбората; осаждают с помощью

100 л этанола; вновь растворяют в

90 л воды; добавляют 1000 r хлористого натрия; доводят окончательный реакции на йодкрахмальную бумагу, проводят проверки через каждые 34 мин.

Когда эти проверки станут отрицательными, реакцию считают закон5 ченной. Затем устанавливают величину рН до 10 путем добавления концентрированного едкого натра, и добавляют 5 г тет1 агидридбората натрия.

; Раствор перемешивают в теченче 15÷.

Не вступивший в реакцию тетрагидроборат натрия уничтожается путем уменьшения величины рН,цо 3, О с помо-;

: щью концентрированной хлористо-во( дородной кислоты. Раствор перемешива ют в течение 15 мин, затем регулиру ют величину рН до 7,0 посредством ( концентрированного едкого натра.

Продукты реакции извлекают путем добавления 10 л этанола. Объемное сообъем до 100 л; добавляют в конечном итоге 100 л этанола, Таким образом получают 2230 r продуктов со следующими характеристиками: титр VSP 54 Е/мг; титр Йин и Весслер (IW) 232 Е/мг; средняя молекулярная масса 4000-5000 дальтон.

Продукты реакции извлекаются путем добавления 10 л этанола, отстаиваются в течение 48 ч, сцеживаются и всплывшая часть удаляется, Осадок вновь растворяют в 9. л воды. Добавляют 1 00 г хлористого натрия и понижают величину рН раствора до 3,8 с помощью концентрированной хлористо-водородной кислоты.

Объем доводится точно до 10 л с помощью деминерализованной воды и при энергичном перемешивании добавляют

10 л этанола. Оставляют отстаиваться в течение 48 ч. Всплывшую часть сифонируют и удаляют. Осадок извлекают, промывают этанолом, измельчают и сушат в вакууме.

Получают 230 r продукта со следующими характеристиками: титр VSP

52 Е/Mr; титр Йин и Весслер (IW)

225 Е/мг; средняя молекулярная масса 4000-5000 дальтон, В примере 3 приведены результаты фармакологических испытаний, проведенных с продуктом примера 1.

На фиг. 1-4 приведены кривые, полученные при изучении в лабораторных условиях изменений времени свертьвания, вызванных в плазме крови человека возрастающими дозами стан— дартного гепарина и продукта из примера 1, В испытаниях, соответствующих результатам данных на фиг, 3 и 4, использовали плазму без тромбоцитов и обедненную фактором XI.

На фиг. 1 — 4 показаны изменения в секундах у тромбина (фиг, 1 ), кефалин-каолина (фиг. 2), свертывания в присутствии концентрированного тромбопластина (фиг. 3) и разбавленного тромбопластина (фиг. 4),.вызванные испытуемыми продуктами, т.е. продуктом из примера 1 (кривые а, а, a > и а ) и гепарином кривые Ь, Ь, Ь и Ь, ) в зависимости от соответственно использованных доз.

Время тромбина и кефалин-каолина представляет собой типы измерения, отражающие действие исследуемых препаратов соответственно на ингибироАктив нос ть анти-Па по Tein и др., Е/мг

IW, ЧЯ1, П /Ч8Г

Е/мг Е/мг

Активность анти-Ха по Tein и др., Е/мг

Соединения

"Стандартный" гепарин

160 160

225 52

232 54

1500 60

120-1 70

1 1 20-170

4,3 120

Предлагаемое

4,3 120

25 2100

Известное

5 15 вание усиленного фактора II и общее свертывание. Кривые на фиг. 1 и 2 показывают, что ИПС в соответствии с изобретением оказывают значительно меньшее действие, чем действие гепарина, на ингибирование активации протромбина и на уровне общего свертывания. Фиг . 3 и 4, представляющие явления, более непосредственно связанные с последовательностью энзиматических реакций, характеристиками наружного свертывания (а именно при относительном отсутствии фактора XIa), показывают эффективность

ИПС по изобретению по сравнению с гепарином.

П р.и м е р 4. Исследование антитромболитической активности продукта из примера 1 на кролике.

Назначение 500 и IW кролику вызывает значительную активность против Ха, а общая противосвертывающая активность остается относительно незначительной. Через 2 ч после назначения активность составляет порядка 0,88 Е/мл, а время кефалин-каолина 0,09 Е/мл.

Испытания в стеклянной колбе и на живом организме показывают более селективную активность MIIC по изобретению, а именно, на уровне ингибирования фактора Ха по сравнению с активностью гепарина, Сравнительные данные по антикоагулирующей активности мукополисахаридов, полученных по предлагаемому

70651 6 и известному способам, приведены в таблице.

Анализ представленных в таблице данных свидетельствует о различном терапевтическом профиле известных соединений и полученных по изобретению.

Формула изобретения

Способ получения биологически активных мукополисахаридов деполимеризацией гепарина в растворе деминерализованной воды в присутствии деполимеризующего агента с выделением целевого продукта осаждением эФанолом, отличающийся тем, что, с целью варьирования терапев" ур тического профиля биологически активных мукополисахаридов, в качестве деполимеризующего агента используют нитрит натрия и деполимеризацию осуществляют при концентрации гепарина

25 5 мас.Х и нитрита натрия - 0,0435 М при рН 2,5 до полного отсутствия ионов NO перед выделением целевого продукта доводят рН реакционной смеси до 7 раствором едкого натра, вво30 дят в нее этанол в объемном соотнопении этанол : реакционная смесь, равном 2:1, и выделившийся осадок растворяют в водном растворе NaC1 при рН 3,8, а выделение целевого продукта проводят при объемном .соотношении этанола и реакционной сме" си 1:1.

157065) С ос тав итель Т . Na рт инск а я

Техред,Л.Сердюкова Корректор М, Кучерявая

Редактор А. Шандор

Заказ 1461 Тираж 446 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101