Рекомбинантная плазмидная днк pbg м3, определяющая синтез эндонуклеазы рестрикции с @ bi

 

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в частности генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез эндонуклеазы рестрикции CFRBI. Целью изобретения является получение новой плазмиды, содержащей гены системы рестрикции-модификации CFRBI. Для достижения цели сконструирована новая рекомбинантная плазмида PBG МЗ с генами системы рестрикции-модификации (R-M)CFRBI, эффективно экспрессируемыми в Е. COLI. Гены R-M системы выделены из экстрахромосомальной ДНК CITROBACTER FREUNDII 4111 и методами генетической инженерии перенесены в Е.COLI.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51) 5 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4466586/31-1 3 (22) 22.07,88 (46) 23,06.90. Бюл. 9 23 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов AH СССР, Киевский научно-исследовательский институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В. Громашевского и Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (72) А.Н, Кравец, А.С. Солонин, Н.П. Кузьмин, Л.И. Глатман, А.Ф. Фролов, З.П. Васюренко и З.Е. Тарутина (53) 575,224.2:547.2(088.8) (56) Mise К. Nakaj ima К. Gene, 33, 1985, р. 357-361.

Изобретение относится к области молекулярной биологии, биотехнологии, в частности генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез эндонуклеазы рестрикции cfrBI.

Целью изобретения является получение новой плазмиды, содержащей гены системы рестрикции-модификации

cfrBI.

Сконструирована новая рекомбинантная плазмида рВС МЗ с генами системы рестрикции-модификации (R-M) cfrBI, эффективно экспрессируемыми в Е. coli.

Рекомбинантная плазмида рВС МЗ размером 7,1 т.п.н., кодирующая эндо„„SU„„1573026 А 1

2 (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК

pBGM3, ОПРЕДЕЛЯОЩАЯ СИНТЕЗ ЗНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ CFR BI, (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК, определяющую синтез эндонуклеазы рестрикции cfr BI. Целью .изобретения является получение новой плазмиды, содержащей гены системы рестрикции-модификации cfr BI. Для достижения цели сконструирована новая рекомбинантная плазмида pBG MÇ с генами системы рестрикции-модификации (R-M)cfrBI, эффективно экспрессируемыми в Е. coli. Гены R-М системы выделены из экстрахромосомальной ДНК

Citrobacter freundii 4111 и методами генетической инженерии перенесены в

Е. coli, нуклеазу рестрикции сЕгВЕ, является неконьюгативной и состоит из MluI фрагмента ДНК вектора pMJR !560 размером 3,9 т.п.н., MluI — фрагмента

ДНК рЕЕ8 размером 3,2 т.п.н., содержащего гены рестрикции и модификации

cfrBI, и содержит три участка узнавания R. EcoRV, расположенных на расстоянии 5,0; 1,6 и 0,5 т.п.н., три участка узнавания RbcoRI, расположенных на расстоянии 3,8; 2,4 и

0,9 т.п.н., два участка узнавания R. Kpnl, расположенных на расстоянии 4,4 и

2,7 т.п.н., и по одному сайту узнавания для рестриктаз PstI, Hind III, Нра I, Xho

1573026

Ъ1а-ген, ответственный за синтез

Р-лактамазы, обеспечивающий устойчивость клеток с плазмидой рВС МЗ к ампициллину;

hsd К. GfrBI-ген, кодирующий эндонуклеазу рестрикции cfrBI, обеспечи"вающий ограничение фаге р 80 vir hsd N. cfrBI-ген, код1лрующий метила:,зу cfrBI обеспечивающий модификацию ,нуклеотидной последовательности UU ,, А/Т А/Т ГГ и защиту ДНК от расщепле ния рестриктазой cfrBI, ori — репли-!. -кон плазмиды рМВТ, !

Конструирование рекомбинантной ,плазмидной ДНК рВС MÇ.

Экстрахромосомальную ДНК, выделен,ную из Citrobacter freundii 4111

:продуцента рестриктазы cfrBI, и ДНК ! ! плазмиды pBR 322 гидролизуют рестрик- 20

0 тазой Pst1 при 37 С в течение i ч в буфере A 10 мМ трис НС1, рН 7,5, 50 мМ NaCl„ 10 iR NgCl, 1 мЕ дитиотреитол, ; фермент инактивируют экстракцией ДНК водонасыщенным фенолом, после чего

2 мкг PstI-гидролузата ДЛК из С. trobacter freundii смешивают с 0,2 мкг

PstI-гидролизата рВК 322, добавляют

АТФ и проводят реакцию в присутствии о

0 1 ед. PHK-лигазы фага 4 при 10 С

В

16 ч. Лигазу инактивируют прогреванием при 65 С 10 мин и инкубационную смесь используют для трансформации компетентных клеток E. cali HB101 по описанной методике.

Среди трансформантов, выросших на 35 селективной агаризованной среде с тетрациклином (20-мкг/мл), отбирают чувствительные к ампициллину (50 мкг/мл), которые затем проверяют на наличие системы рестрикции-модификации cfrBI, 40

Проведенный анализ позволяет заключить, что все они являются контрансформантами делеционных вариантов плазмиды pBR 322 и плазмиды Ъ2Е8, кодирующей систему рестрикции-модификации 45

cfrBI.

На следующем этапе в качестве вектора используют РНК плазмиды pNJR1560, содержащую уникальный сайт MluI в структурной части гена lacI %. ДНК pZE850 и ДНК pNJR 1560 гидролизуют рестриктазой NluI в условиях, рекомендованных фирмой New England Biolabs, 4 мкг.

NluI-фрагмента ДНК вектора pMJR 1560 дефосфорилируют щелочной фосфатазой из кишечника теленка в условиях, рекомендованных фирмой Boehringer Manchein, экстрагируют три раза фенолом, один раз хлороформом и дважды пересаждают спиртом, 2 мкг дефосфорилиованного MluI фрагмента pMJR 1560 смешивают с 4 мкг MluI фрагментов

pZE8 и проводят реакцию в присутствии

ДНК-лигазы фага Т4 в описанных условиях. Полученной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е. coli

К802, трансформанты подращивают 2 ч в бульоне LB инфицируют фагом p80vir

Э

Ц с множественностью заражения 10 и высевают на агаризованную среду, содержащую 50 мкг/мл ампициллина, Из клонов, резистентных к ампициллину, выделяют плазмидную ДНК pBG MÇ известными способами, Проведен анализ наличия рестриктазы cfrBI в клетках Е. coli, Для этого клетки E. coli K802/

/рВС МЗ выращивают в 10 мМ ЬВ бульона до поздней логарифмической стадии роста, собирают центрифугированием, ресуспендируют в 5 мл буфера В, (10 мИ трис НС1, рН 7,5, 50 мМ NaC1, 10 мМ

ЭДТА„ 10 мМ 2-меркгптоэтанола), раз-. рушают ультразвуком, центрифугируют при 6000 об/мин 1 ч для освобождения от клеточных обломков.

Для определения активности готовят разведения экстракта в буфере С (10 мИ трис НС1, рН 7,5, 50 мМ NaC1, 10 мМ

ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 100 мкг/мл 1: 10, 1: 100, 1: 200, 1:400, 1:1000. В инкубационную смесь (9 мкл), содержащую 10 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ MgC1 z, 7 мМ ДТТ, 50 мМ NaC1, 1 мкг PHK hara 3 с 1857 добавляют

1 мкл соответствующих разведений эксто ракта и инкубируют при 37 С в течение

1 ч. Результаты гидролиза проверяют с помощью электрофореза.

1 мл полученного экстракта содержит до 2х10 единиц активности.

Таким образом, получена рекомбинантная плазмида рВС ИЗ, содержащая гены системы рестрикции — модификации

cfrBI. Данная плазмида обеспечивает сравнительно высокий уровень синтеза эндонуклеазы рестрикции сйгВТ. Наличие детерминанты резистентности к ампициллину позволяет переносить плазмиду pBG MÇ путем трансформации в разные штаммы Е. coli оптимизировать культивирование целевых штаммов и выращивать штамм продуцент в селективных условиях.

Формула изобретения

Рекомбинантная плазмидная ДНК pBG

ИЗ, определяющая синтез эндонуклеазы

Составитель Е, Кузнецова

Редактор Н. Бобкова Техред M.Õîäàíè÷ Корректор С.Шекмар

Заказ 1621

Тираж 500

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r Ужгород, ул. Гагарина, 10

5 15730 рестрикции cfrBI размером 7,1 т.п ° н., содержащая: MluI — фрагмент ДНК вектора pMJR 1560 размером 3,9 т.п.н., MluI — фрагмент ДНК pZE8 размером

3,2 т,п.н. с геном системы рестрикциимодификации cfrBI, сайты рестрикции: три участка узнавания рестриктазой

EcoRV, расположенных на расстоянии

5,0 т.п.н., 1,6 т.п.н; 0,5 т.п.н, три участка узнавания рестриктазой

Ec6RI, расположенных на расстоянии

3,8 т,п.н, 2,4 т,п.н, 0,9 т.п.н; два участка узнавания рестриктазой 1

KpnI, расположенных на расстоянии

4,4 т.п.н, 2,7 т.п.н; уникальные участки узнавания для рестриктаз Pstl, HindIII, HpaI u

XhoI генетические маркеры:

Ъ1а-ген, ответственный за синтез р- лактамазы, обеспечивающий устойчивость клеток к ампициллину; hsd R

cfrBI-ген, кодирующий эндонуклеазу рестрикции cfrBI, обеспечивающий ограничение фага в 80vir; hsd М cfrBI-ген,. кодирующий метилазу cfrBI, обеспечивающий модификацию нуклеотидной последовательности LЦ gА/Т А/Т ГГ и защиту

ДНК от расщепления рестриктазой.