Способ получения щелочной фосфатазы

 

Изобретение относится к технической микробиологии, а именно к способам получения щелочной фосфатазы из ESCHERICHIA COLI, которая находит применение в геноинженерных экспериментах и молекулярной биологии. С целью повышения степени очистки целевого продукта в способе проводят разрушение клеток из штамма E.COLI ВКПМ В-629 (C 4) термошоком, отделение бесклеточного экстракта центрифугированием, фракционирование сульфатом аммония, обессоливание и хроматографию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. В дальнейшем фермент обессоливается диализом и проводится хроматография на колонке с CL-сефарозой 6В, связанной с лигандом-красителем красно-коричневым 2К.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (51)5 С 12 N 9/14 //(С 12 N 9/14, 12 R 1:19) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ П<НТ СССР (21) 4393412/30-13 (22) 15.03.88 (46) 07.07.90. Бюл. Р - 25 (71) Научно-производственное объединение "Фермент" (72) P. П.Марцжиаускас, P.Â. Лакачаускене, В. С. Дайлиден айте, О. Ф. Суджювене и И.-Г.И.Песлякас (53) 577. 15 (088. 8) (56) Garen.À., Leviathal С., Biochim, Biophys. Acta, 1960, 38, р.470-483. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЩЕЛО»1НОЙ ФОСФАТАЗЫ (57) Изобретение относится к технической микробиологии, а именно к способам получения щелочной фосфата1 .Изобретение относится к технической микробиологии, касается получе ния фермента щелочной фосфатазы Escherichia col i и может быть использо-. вано в генной инженерии, молекуляр- . ной биологии и иммуноферментном анализе.

Целью изобретения является повышение степени очистки целевого продукта.

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки Escherichia coli ВКПИ В-629 (C ) разрушает термошоком при 82 2 С ,15 мин, отделяют бесклеточный экстракт центрифугированием, фракционируют сульфатом аммония, обессоливают и хроматографируют на колонке с ДЭАЭцеллюлозой ДЭ-52 ° Затем фермент обессоливают диализом и хроматографируют на колонке с CL-сефарозой 6В, связан2 зы из Escherichid, coli, которая находит применение в генноин eHepHb»x экспериментах и молекулярной биологии. С целью повышения степени очистки целевого продукта в способе проводят разрушение клеток из штамма Е. co1i ВКП»» В-629 (С ) термошоком, отделение бесклеточного экстракта центрифугиров анием, фракцион иров ание сульфатом аммония, обессоливание и хро.—

: матографию на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой. В дальнейшем фермент обессоливается диализом и проводится хроматография на колонке с CL-сефарозой 6В, связанной с лигандом-,красителем крас" но-коричневым 2К.

I ной с лигандом-красителем красно-коричневым 2 К в концентрации 1,2-2,5мкм красителя/мл сефарозы в 0,005-0,05 И трис-НС1 буфере рН 7,0-8,0, содержащем 0,005 М ZnC1<., В результате получают практически гомогенный препарат (чистота 98,4Е), свободный от .нуклеазных примесей.

Пример 1. Получение аффинного сорбента.

К 180 мл CL-сефарозы 6В прибавляют о

40 мл воды, нагревают до 60 С и при перемешивании механической мешалкой прибавляют небольшими порциями 478мг красно-коричневого красителя 2К, растворенного в 20 мл воды. После перемешивания в течение 30 мин прибавляют 24 г NaC1 и перемешивают при 60 С еще 1 ч. Смесь нагревают до 80 С, прибавляют 2,1 г Na C(. z, перемешива.—

1576563.ют 2 ч.,фильтруют и отмывают холодной и горячей (80 С) водой до получения бесцветного фильтрата. Получают сорбент, содержащий 1,4 мкм красителя

5 красно-коричневого 2К/мп сефарозы 6В.

Выделение и очистка щелочной фосфатазы.

Получение ферментного экстракта.

500 r. замороженной биомассы клеток 10

Е. coli ВКПМ В-629 размельчают скальпелем и заливают 2,5 л 0,01 M трисНСl буфером рН 7,5, содержащем 0,01 M

MgCl g, и помещают в ледяную баню. Содержимое стакана перемешивают до полу- 5 чения гомогенной суспензии. Суспензню биомассы ставили в кипящую баню, постепенно в биомассу заливали 2,5 л кипящего 0,01 M трис-НС1 буфера, рН 7,5, содержащего 0,01 ИВС1, с целью доведе". . н ия температуры кле точн ой су с пен з ии до 82 2 С. Термошок проводят при этой температуре 15 мин.

После проведения термошока экст- 25 ракт охлаждают до 4 2 С, центрифугируют при 10000 g 1 ч "и супернатант используют для выделения Аермента.

Конце н трир ов ан ие и Аракцион иро в ание Аерментного экстракта сульфатом аммония.

4 л насадочной жидкости концентрируют ультраАильтрацией кассетным прибором "Pellicon" до 500 мл. К концент— рату при постоянном перемешивании добавляют сухой сульАат аммония до 60% насыщения. Осадок отделяют и отбрасывают, а к супернатанту добавляют сухой сульфат аммония до 85 . насыщения.

- Осадок собирают центрифугированием, растворяют в 150 мл 0,01 И .трис-НС1

40 буфера, рН 8,0, содержащего 0,001 M и диализируют в течение 18 ч против 10 л указанного буфера. Получаю т 1 80 мл диализ ат а, ХроматограАия щелочной фосфатазы

Е. coli на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой

- ДЭ-52.

Диализат фермента (180 мл) подвергают хроматограАии на колонке {5 25 см) с ДЭАЭ-целлюлозой, уравнове- 50 шенной диализным буАером. После нанесения ферментного раствора, колонку промывают 1,5 л исходного буфера, а затем линейным градиентом (Зл) NaC1 от О до 0,5 М в исходном буфере, соби-55 рая фракции по 10 мл. П(елочная Аос фатаза элюируется в пределах 0,1—

0,15 M NaC1. Объединенные активные фракции (150 мл) осаждают сульфатом аммония до 80 -ного насыщения. После центрифугирования (22000 g, 15 мин)) осадок растворяют в 40 мл 0,01 М трис-НС1 буфера, рН 7,5, содержащего

0,001 М ZnClg, и диализуют 18 ч против 2 л того же буАера. Получают

50 мл диализата.

Хроматография Аермента на колонке с красителем.

Диализат щелочной фосфатазы (50мл) подвергают хроматограАии на колонке (2,5 15 см) с CL-сефарозой 6В краснокоричневый краситель 2К, содержащей

1,4 мкм красителя/мл сефарозы, уравновешенной диализным буфером.

При этом фосфатаза не сорбируется и выходит острым пиком, а нуклеазные примеси сорбируются и могут быть элюированы при повышении ионной силы до 1 M КС1.. Фракции щелочной фосАатазы объединяют и концентрируют.

Концентрирование конечного препа-. рата.

Объединенные фракции диализуют против 1 л 0,01 М трис-НС1 буфера рН 7,5, содержащего 0,001 М MpC1, .

0„05 И NaC1 и 50% глицерина (по обьему) . Диализ продолжают в течение 12 ч, Препарат помещают в предварительно охо лажденную емкость и хранят при -20 С, Выход щелочной АосАатазы Е, coli составляет 33% с удельной активностью

30 ед/мг белка. Ферментный препарат не соде ржит нуклеазных примесей и пригоден для использования в генноинженерных экспериментах и молекулярной биологии. Активность щелочной фосфатазы Е, coli определяют по гидролизу 4нитрофенил фосАата. За единицу активности принимают то количество фермента, которое гидролизует 1 мкм 4-нитрофенилАосфата за 1 мин при 250С. В полученном препарате отсутствуют дезоксинуклеазные, дезоксиэкзонуклеазные и рибонуклеазные примеси.

Пример 2. Способ получения щелочной АосАатазы E coli аналогичен примеру i однако при хроматографии на колонке с красителем используют сорбент, содержащий 1,2 мкм красителя/мл сефарозы, а исходный буфер соцержит 0,005 M трис-НС1, рН 7,0 и

0,0005 М ZnC1>.

Пример 3. Способ получения щелочной фосАатазы Е. coli аналогичен примеру 1, однако при хроматографии!

576563 6

0,00001 М ZnCly Полученный препарат содержит делоксизндонуклеазные и ри"- бонуклеазные примеси.

Составитель В.Варламов

Редактор Н. Рогулич Техред Л, Сердюкова Корректор А.Обручар

Заказ 1830 Тираж 483 Подп ое

ВНИИПИ Государственного комитета по .изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35,, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, .ул. Гагарина, 101 на колонке с красителем используют сорбент, содержащий 2,5 мкм красите ля/мл сефарозы, а исходный буфер содержит 0,05 М трис-НС1, рН 8,0, и

0,005 М ZnC1> .

Пример 4. Способ получения щелочной фосфатазы Е. coli аналогичен прыкеру 1, однако при хроматографии на колонке с красителем используют сорбент, содержащий Змкм красителя/мл сефарозы, а исходный буфер содержит 0,1 М трис-НС1, рН 8,5,и 0,01 М .ZnClg. Полученный препарат содержит дезоксиэндонуклеазные и рибонуклеаз-. ные примеси.

Пример 5. Способ получения щелочной фосфатазы Е. coli осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонке с красите- 20 лем используют сорбент, содержащий

1 мкм/мл сефарозы и исходный буфер содержит 0,001 М трис-НС1 рН 6,5 и

Формула из обре тен ия

Способ получения щелочной фосфатазы предусматривающий разрушение клеток Escherichia col i температурным шоком, фракционированне сульфатом аммония,с последующей хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, о т л и ч а юm и и с я тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта,. используют клетки штамма Escherichia

coli BKIIN В-629, а после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе проводят хроматографию íà CI.-сефарозе с иммобилизованным красителем красно коричневым 2К в концентрации 1,2-2,5 мкм красителя/мл геля в 0,005-0,05 М трис-НС1 буфере с рН 7,0-8,0, содержащим 0,0005-0,005 М ZnC1>.