Способ нанесения водонерастворимого биоцида на поверхность гидрогелевой подложки

 

Изобретение относится к испытаниям материалов на устойчивость к воздействию микроорганизмов и может ,быть применено при определений эффективности биоцидов. Целью изобретения является наиболее полное .нанесение биоцида на подложку.Готовят раствор водонерастворимого биоцида в органическом растворителе. Осаждение биоцида проводят на дно горизонтально (по уровню) установленного сосуда путем испарения растворителя. Затем непосредственно в сосуде с осажденным биоцидом синтезируют гелеобраэную подложку или заливают расплавленную агаровую среду. Для нанесения биоцида на агаровую питательную среду сосуд должен быть выполнен из фторопласта, в случае с гидрогелевой подложкой он ,. может быть выполнен из стекла. Способ позволяет добиться более полного нанесения биоцида на поверхность подложки и ере2- ды и до 10 раз повысить равномерность нанесения биоцида, это позволяет точнее оценить эффективность различных биоцидов. 1 ч.п. ф-лы, 4 табл. W е±

СОЮЗ СОВЕТСНИк

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУ6ЛИК ц9) Sinn

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЙ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОЧИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM

IlPH ГКНТ. СССР (4б) 15.05.91, Бюл. Р 18 (21) 4222196/13 (22) 03.04.87 (72) Х.Н.Фидлер, Д. В.Замбахидэе, О,А.Хачатурова,, Ю.В.Г!оисеев, К.З.Гумаргалиева и 0.A.Семенов ,(53) 576.8.995.3(088.8) (54) СПОСОБ НАНЕСЕНИЯ ВОДОНЕРАСТВОРИМОГО БИОЦИДА НА ПОВЕРХНОСТЬ ГИДРОГЕ ЛЕВОЙ ПОДЛОЖКИ (57) Изобретение относится к испьгганрям материалов на.устойчивость к воздействию микроорганизмов и может .быть применено ври определений эф;фективности биоцидов. Целью изобретения является наиболее полное .нанесение биоцида на подложку. Готовят раст вор водонерастворимого биоцида в орИзобретение относится к иапытаниям материалов на устойчивость к воздействию микроорганизмов и .может быть применено при определении эффективности биоцицов и других работах, связанных с равномерным нанесением биоцидов на поверхность материалов изделий и питательных сред.

Цель изобретения — более полноенанесение биоцида на подложку.

Готовят раствор водонераствори-, мого биоцида в органическом растворителе. Биоцид осаждают путем ис(51)5 С 12

Ю биоцида проводят на дно горизонтально (по уровню) установленного сосуда путем испарения растворителя. Затем непосредственно в сосуде с осажденным бноцидом синтезируют гелеобраэную подложку или заливают расплавленную агаровую среду. Для нанесения биоцида HR агаровую питательную среду сосуд должен быть выполнен иэ фторопласта, в случае с гидрогелевой подложкой он,может быть выполнен из стекла. Способ позволяет до.-. биться бЬлее пол!1ого нанесения биоцида на поверхность подложки, и сре1.. ды и до 10 раз повысить равномерность g,: нанесения биоцида,,это позволяет точнее оценить эффективность различных бноцидов. 1 э.п. (b-лы, 4 табл.

Ю парения растворителя на дно горизонтально (по уровню) установленного сосуда и синтезируют гепеобраэную подложку непосредственно на осажденном биоципе или заливают расплавленную агаровую среду. Для нанесения биоцида на агаровую питательн..ю среду сосуд должен быть выполнен иэ фторопласта. В случае гидрогелевой подложки, синтеэируемой пол мериэацией или поликонденсацией монойеров, сосуд может быть выполнен иэ стекла, Пластинку агаровой среды переворачивают так, чтобы наверху была поверх1577364 ность с биоцидом, гелеобразную подложку помещают на питательную среду, стерклиэуюг и эасевеют спорами мик роскопических рибок и определяют ,паг-период .роста и биомассу.

Примеры конкретного применения способа нанесения водонерастворимого . биоцнда на повар"хность геиеобразующий подложки.

Пример t, Для осаждения водонерастворимого биоцида "биоцина"9 представляющего собой смесь двойной цинковой соли этиленбисдитиокарбо-, аминовой кислоты и метилового эфира-N-бензилимидоэолин-2-карбоаминовой кислоты, на гидрогелевую подложку с концентрацией, например, 1 10 1,5 ° 10 моль/см, готовят раствор

"биоцина" в хлороформе молярной концентрацией 1 ° 10 моль/дм . В стеклянную чашку Петри внутренним диаметром 100 мм заливают 5 см раствора и ставят ее на полку термостата, установленную строго горизонтально по уровню. В термостате устанавливают температуру 55 С и проводят испарение растворителя до постоянного веса, чашки Петри с осажденным "биоцином".

После этого подготавливают состав для синтеза гидрогелевой подложки, : для чего в стеклянный стакан вмести.мостью 150 см заливают 70 см дистиллированной воды, загружают туда 70 мг перекиси бенэоила, 30 см этиленгликольмонокатакрилата и

1,5 см .,этиленгликольдиметакрилата.

Смесь уи ательно перемешивают и 40 см смеси заливают в чашку Петри, на дно которой, как указано выше, осажден равномерный слой водонерастворимо" го биоцида "биоцина". ПосЛе этого чашку Петри со смесью помещают в . термостат, полки которого устанавЛи вают строго горизонтально по уровню и ведут полимеризацию смеси при 90 С в течение 2 ч, По окончании полимеризации чашку Петри с содержимым вынимают из термостата, охлаждают до комнатной температуры и извлекают заполимеризованную подложку с приставшей к ней равномерной пленкой - биоцина". Подложку десятикратно от.мывают дистиллированной водой от мономера, димера .и перекиси бензоила. Полноту отмывки контролируют спектрометрнчески при длине волны

220 нм.

Остаток биопяйа,8 amxe lIeTpH после извлечения подложки определяют, путем отмывки чашки Петри хлороформом1 испарением его до постоянного веса и последующим гравиметрическим определением остатка. Исследования показывают, что остаток "биоцина" не превышает 0,0004 г (в пределах ошиб10 ки измерения}. Равномерность распределения биоцида на поверхности гидрогеля оценивают следующим образом, Специальным штапом-ножом вырЕзают иэ подложки с нанесенным биоцидом 5-6

)5 цилиндрических образцов диаметром

2 см и экстрагируют с поверхности образца. Растворение проводят в течение 1,5 ч при 40-50 С. Концентрацию биоцида в растворе определяют спек

20 трометрическим методом в УФ-области спектра при 220 нм.

Концентраци;о "биоцнна" íà f eM поверхности подложки {Сэ) рассчитывают по формуле:

?5

S ° С $ =

1 000 S где С - молярная концентрация "био цина" в растворе хлорофор30 ма, моль/дм ;

8 — - площадь дна чашки Петри диаметром 100 мм,см .

Подставив в формулу значения С и 8 из опыта, получают

3$

5 1 57<10 -4

Я

Ф

1000 314 S

С " -"- - - — 1 ° 10 моль/см .

Равномерность распределения био" цина и его концентрация на поверхности подложки составляют . 1 ° .10 А

1,5 10 моль/см (табл.1).

Промытые гидрогелевые подложки помещают в чашки Петри биоцидным

45 слоем кверху, стерилизуют, устанавливая их в боксы под ртутными или ртутно-кварцевыми лампами на расстоянии 50А10 см с выдержкой в этих условиях 4,0+О, 1 ч. °

В дальнейшем -гидрогелевые подложки с осажденными на них различными концентрациями "биоцииа s моль/см . используют для определения его биоцидиой эффективности по лаг-фаве и

55 кинетическим параметрам развития грибов видов: Aspergillus огузае, Аврегя111ов niger, Aspergillus ter-

reus, Chaetomium g1obosum, Paecilomyces sarioti, РепЫЛ1юш Ушит

5 157 1364

1овм«, Pen icil 1 ium chrysogenum,Penicil1ium cyclopium Irichoderma vi-

r i(1e.

Испытания биоцидной эффективности

"биоцина" проводят на гидрогелевык подложках с осажденным на них водонерастворимым "биоцином(различных поверхностных концентраций. Для это" го в стерилизованные чашки Петри за- «О ливают среду Чапека-Лскса и укладывают в них гидрогелевые подложки так, чтобы поверхность подложки, свободная от бисцида, контактировала с питательной средой, а на поверхность, со- 15 держащую биоциц, равномерно наносят

1 мл спор грибов, содержащий 1,00+ г 0,01 Мпн, спор, выдерживают при

29 й2 С и относительной влажности. 90% и через кащ ые семь суток проводят 2Î отборы с определением выросшей биомассы.

Рассчитывают кинетические параметры "биоцина" по формулам

mc; мак

ЙЕ Я

1+а ехр(-Ь

1 i (М 1 о ) b;C;

b, --Ь;. где mc, „„

" с °

in а;

- максимальное значение удельной биомассы, достигнутое при развитии грибов в присутствии биоцида каждой иэ концентраций и в контрольной пробе, мг/см

Я или мг/дм 1 среднее арифметическое значение удельной биомассы для каждой из . кснцентраш и и в контрольной пробе при каждом из отборов, мг/см или мг/дм ; — минимальное экспериментально полученное значение лаг-фазы для данной. концентрации биоцида и в контрольной пробе, ч; — продолжительность выдержки, после которой произведен отбор, ч; — кинетический параметр, характеризующий способйость споры образовывать биомассу при. данной концентрации биоцида и,в контроль" ной пробе;

b; - кинетический параметр, характеризующий удельHyN rKopocTs развития микроорганизмов на данной питательной среде (при i-.òîé концентрации биоцида), ( ч э

К; - константа, характеризующая зависимость лаг-фазы от концентрации данпсгс биоцида;

К с — константа, хагактериэующая зависимость удельной скорости роста грибов от концентрации и численно равная концентрации био" .. цала, при которой параметр b уменьшается в два раза ио сравнению с развитием грибов на среде, не содержащей биоцида;

С; — концентрация биоцида, 30 включая С; = 0„ ст нулевого значения до

С еак«: f

1,1 â€,минимальное эначение лаг-фазы при каждой

35 концентрации биоцида, ч;

1.(« " минимальное значение лаг-фяэы в контрольной пробе, ч, 40 b — кинетический параметр, характериэуюпп и удельную скорость развития грибов на данной питательной среде 8 от45 сутствие бноцида.

Повторность в опыте по испытанию антигрибного действия бисцина 30кратная (30 образцов) (табл.1).

Результаты оценки биоцидной ак»

50 тивности испытуемого соединения пред-, ставлены в табл.1. При использовании данного способа ошибка при определении биомассы микромицетон, развивающихСя на гиДрогелевсй подложке, 10—

15%, Установлена величина лаг-фазы в развитии микроорганизмов в зависи1 мости от концентрации биоцина в подложке и константы К и Кь, характе,1577364 ризуюп,ие биоцидную активность биоцина.

П р и, м е р 2. Осаждение "биоцина на г1оверхность агарйзованйой питательной среды проводят по следующей методике.

Готовят раствор "биоцина" в хлороформе молярной концентрацией 1 х х 10 моль/дм, Затем в сосуд типа чашки Петри с внутренним диаметром

100 мм, выполненный из фторопла" ста-4, заливают 5 см приготовленного раствора и ставят его на полку термостата, установленную строго горизон" . тально по уровню. В термостате устанавливают температуру 55 С и проводят испарение растворителя до постоянного веса сосуда с осажденным на дне,"биоцином". После этого подго- 20 тавливают агаризованную среду ЧапекаЦокса, для чего 0,7 г калил фосфорнокислого однозамещенного, 0,3 г калия фосфорнокислого двухзамещенного З-водного, 0,5 г магния сернокисло- 25 го 7-водного, 2,0 г калия хлористо- го, 0,01 г железа сернокислого закисного 7-водного растворяют в кол- бе в 500 см дистиллированной воды, тщательно перемешивают и добавляют -, 30 дистиллированную воду ro 1000 см, затеи в раствор добавляют 20 r микробиологического агара и нагревают на водяной бане до полного расплавления агвра. При нагревании колбу со средой взбалтывают, В полученную однородную массу добавляют 30 г сахарозы, после чего содержимое колбы тщательно перемешивают.

В стерилизованную фторопластовую 40 чашку Петри с осажденнным на дно равномерным слоем "биоцина" . заливают

5 см расплавленной агаризованной среды Чапека-Докса. После этого чашки Петри накрывают крышками и стерилизуют .при давлении 0, 1 МПа и температуре 121 С в течение 15-20 мин, . после чего охлаждают в стерильных условиях и вынимают из чашки Петри застывшую агаризованную подложку, . на нижней поверхности которой находится приставший к ней равномерный слой "биоцина". Помещают эти подложки в стеклянные чашки Петри, причем слой "биоцина" должен быть обращен кверху. Б дальнейшем агаризованные подложки с осажденными на них различными концентрациями "биоцина" в моль/см используют для определения его биоцидной эффективности по ла -. фазе и кинетическим параметрам развития грибов, указанных в примере 1 (табл.2).

Эти исследования g расчет кинетических параметров эффективности биоцидов проводят как в примере 1. Повторность в опыте 30-кратная (30 образцов).

При нанесении биоцида на агаровую питательную среду Чапека-Докса ошибка в определении биомассы микромицетов составляет в среднеи 15Х. Установлен период лаг-фазы в развитии грибов в зависимости от концентрации биоцина на поверхности среды (табл.2} и рассчитаны величины констант Кс и

К, характеризующие биоцидную эффективность веществ, Пример 3. Оценка способа нанесения биоц1щов на гидрогелевую подложку и агаровые по сравнению с известным способом.

Описанным в примерах 1 и 2 способом осаждают на гидрогелевую подложку и среду Чапека-Докса биоциды: биоцин, 2-индонен, амарин (7,5 дкгидро-2,4,5 трифеннлимидазол), 3-цикло-гексил-этоксниминолино-4-хлор-2,5-диокси-3-пиралин (табл.3) и рассчитывают биоцидную активность 2-индонена и биоцина (табл.4).

Согласно известному способу водонерастворимые биоциды также осаждают из раствора в органических растворителях путем испарения жидкой фазы.

Затем осажденный биоцид накрывают гидрогелевой подложкой. Биоцид прилипает к подложке, и его поверхностную концентрацию рассчитывают исходя из количества биоцида в растворе.

Экспериментальное осуществление известного способа показывает, что не весь осажденный биоцид прилипает к поверхности и намного (в 10 раз) менее равномерно распределяется по поверхности подложки и агаровой питательной среды, Равномерность распределения, например, биоцина по поверхности подложки или среды состав.- ляет 1 <О + 2 4 ° 10 и 1 ° 10 й1,4 х х 10, а при нанесении известным способом — 1 ° 10 + " 7,2 ° 10 и 1 10

+ 9а10

Результаты оцейки биоцидной активности веществ при их нанесении

1577364 I0 на гидрогелевую подложку н агаризованную среду способом, описанным я

I примерах 1 и 2, н известнйм приведены в табл,4,.

Данные табл.4 свидетельствуют, что оиибка в определении биомаcñû .при нанесении биоцидов-бноцина и 2-индопена — известным способом составляет. 25-35X °, В связи с этим полученные значе ния константы Ке для испытываемых . биоцидов практически между собой не различаются, в то время как биоции значительно эффективнее 2-нндонена.

При использовании описанного в примерах 1 и 2 способа нанесения водоне, растворимых "биоцидов на поверхность подложки и среды ошибка, при определении биомассы микРоорганнэмов сокрацается до 1Ъ-IS_#_, в связи с чем повышается точность определения .константы К и поэтому можно объективно определить сравнительную активность биоц щов и их эффективность.

Данные табл.4 показывают также, что при использовании предложенного способа удается более точно. определить продолжительность периода адап тации микроорганизмов при различных концентрациях биоцпдов (ла -фазы).

Так, например, для биоцина период адаптации (лаг-фаза) для более чем . 80X образцов одинаков, а согласно известному способу значения лаг-Фазы имеют большой разфрос, что вносит большую ошибку при определении констант К и К, которая достигает 3540Х, Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что способ позволяет со значительно большей точно". стью определять лаг-фазу и кинетические константы К и Кс развития микроорганизмов в зависимости от применяемого биоцида, что дает возможность оценить их эффективность.

Формула изобретения

1..Способ нанесения водонерастворнмого биоцида на поверхность гидрогелевой подложки, предусматриваюций приготовление раствора биоцида.в органическом, растворителе, осаждение биоцида на дно,сосуда путем испарения растворителя, приготовление гелеобраэуюцей подложки и контактирование

25 биоцида с подложкой, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью более полного нанесения биоцида на подлож" ку, приготовление и контактирование гелеобраэующей подложки осуществляют в том же сосуде непосредственно на осажденном биоциде.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ющ и и с. я тем, что при нанесении биоцида на .поверхность агаровой Пи-. тательной среды для осажпения биоци35 да используют сосуд иэ Фторопласта. 2. ° (ф

1577364 ф

В о.!

Ф!

1 / о а м1 о о"

+(,о „, л .»ч

CV Ф а . а (Я О ОФ а а

ch hl л е

a°, л о д,, Ф) л . а

»Ч е»

i6 cf

° ((+(» Ъ М а а о CV а °

00 ОЪМЪ о »

° ° а а

СЧ

+(м о Ь. е °

4 ф е» а ю ъф л

1 о

CV а

ФЧ б!!

» о

Ъ»

Ф Ъ а б! о

Ф !

Е О о й

t!!

И f м о

cd б

М

К!! с о б! с а б! ь

Ф

Ю л ! ъ!

Э f

1

Р

+!

Ф о

00 а б!

Ф о

° 1 %

° °

О

t(О !!! !!!

g ф

Ф

О

Ва

О . ж

М

f0 С4

lh о ь . 1

Х Ф

О

Х О

" "3 !! о а

ye u

t0 3

О

f ° ж О

С4

А cd и ж

5(o1577364 л о о о ! - ° л а а

О а ю б! 4.I б! +! 0 ф оооо (Ф»! ф 1ф

Ф л л а л

° - (4 C4 Yl

+c 4f +> 4c

О оооо

Ю Ф» Ч

r! ! !! ю оооо

СЧ ОО лл б а л !

- с оо б! б! tt 4!

7 9

»

- 5 СЧ б. ф Щ ф (P

»- (4 а а л а (! W с 1 C) Ф! 4!

Р а NC4

Ф 4!! 4l оооо

О

4 me @i 3

g, О,ф !б

)577364

16 л

» о м

CO о

М » а б

Ф \

» л

* м

c»I о б о

М о

Ф о а! о

» ° .о д /м ъ а

CO сс

o} м.л ф 3

3 Ф ю л

3 » б »

<и м

Ф м

° »

ФЧ ф л ф а! м в

» а! ф

I »i! Ю

» сс

cl

» е. е

» ° м ю а! м

° »

% м

° -, м

» а м. и

Ю

» ° м ач м и м» 3 Q c»c й

«Я

Ф ъ CO о

3 1 а о

«

Ci

» о б » » » о о

»

Ф а»

° о л

° 0»

}mojo gP ф}л л

joj- }+

}ф|ф ф л л ь o Ь

»с

1о

4»3 о о сО. Ы!

° CC Л а

t4 Ю н

° 9

cc 4

Ъ Ъ м е

Ю Ф

° ф

° . ° ° . °

» ° е е .е.. CC в, м 4!

».

» ° »

+c н . v а a Ь а о

I c4

+l и

l Р

O О е сс

Ф O

Я C

° c ь !

» °

° Ю а \

ctl Ig e

+! . б! сп о о н о

Ю о а м

+!

М о о ю

» б

+! Vi л CC

» *

М cIl

C»l, N

Х

«

Ф !а

Ь о о о" фФ б

» м

Ф о

1 577364

4Л

Ф о

° 4 л

° Ф

O о

Ч4

Ю

444

Ф о

В

4а4

О м и о

Л

441 41 м

Cl 4 Ъ

V4

Ф

° О

В м

1 1

4Ч

Ф °

4 4

Ф м

444 4»

Ь В

+ Я

О

+1

Ь4

44

+а и

«1сЧ л . л о о

4п

4 \

+В

М О

4Ч

° n

Ф1 а

+1 и

В

44

+1

v

"o 44 у о

4Ч 4 4Ч

Э

В

Ф

° 4

6 и х

Оа

Ь

144 С4 а о

° 4 С

И 44 у

В Ф

1 Ф

4Ч Ф

3

1

g t4a4

Ф

2 а ф

Д е О

4Ч

К и

Ф о

4 Ъ

Л 444 а °

Vi +

an В. с в

4 1 1 1 л со(о а)м

%O 4Р o Ь сФ

1.

j(3 (Й

*iI

4 SW

1:

fNФ

1 «ф4 ф а э

Р юв>4

14 Ф

st! сс3

О 44