Способ относительной оценки степени патогенности штаммов х - вируса картофеля

 

Изобретение относится к фитопатологии, может быть использовано сельскохозяйственными опытными станциями, селекционными центрами, НИИ сельского хозяйства. Цель изобретения - повышение достоверности способа оценки степени патогенности штаммов. Степень патогенности штаммов Х-вируса картофеля (ХВК) оценивают по активности накопления в клетках мезофила ХВК-индуцированных ламинарных структур, митохондрий, мембран агранулярного эндоплазматического ретикулума. Более патогенным считается тот штамм ХВК, который индуцирует большее накопление этих ультраструктурных компонентов. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

А1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21 ) 437 2862/30-13 (22) 01.02.88 (46) 23.04.90. Бюл. К- 15 (71) Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения AH СССР (72) А.В.Реунов, Л.А.Лапшина, В.Г.Рейфман и С.А.Романова (53) 576.858.8:632.937.16(088.8) (56) Сборник трудов биолого-почвенного института ДАН АН СССР. 1 977, т. 46 (149 ), с. 100-1 06. (54) СПОСОБ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ ОЦЕНКИ

СТЕПЕНИ ПАТОГЕННОСТИ UJTAMNOB Х-ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ (57) Изобретение относится к фито"Изобретение относится к фитопатологии, в частности к методике отно,сительной оценки патогенности штам мов Х-вируса картофеля.

Цель изобретения — повьпнение достоверности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

В опыте используют две группы: растений-индикаторов. В первую группу входят растения, зараженные сильнопатогенным штаммом Х-вируса картофеля, во вторую — слабопатогенньм.

Растение-индикатор в возрасте 3-4 недель заражают исследуемыми штаммами. Через 5 сут. из каждой группы готовят препараты для исследования под электронным микроскопом ультраструктуры. клеток листа. Для этого небольшие кусочки ткани с верхних листьев фиксируют, обезвоживают и заключают в эпоксидную смолу. ($g)$ С 12 Q 1/00, А 01 И 63/04

С 12 Н 7/00 патологии, может быть использовано сельскохозяйственными опытными станциями, селекционными центрами, НИИ сельского хозяйства. Цель изобретения — повьппение достоверности способа оценки степени патогенности штаммов. Степень патогенности штаммов

X-вируса картофеля (ХВК) оценивают по активности накопления в клетках мезофила ХВК-индуцированных ламинарных структур, митохондрий, мембран агранулярного эндоплазматического ретикулума. Более патогенным считается тот штамм ХВК, который индуцирует большее накonление этих ультраструктурных компонентов. 1 табл.

Иэ полученных блоков готовят срезы, которые просматривают на однощелевых блендах в электронном микроскопе. Исследуют активность накопления ламинарных структур, митохондрий и мембран агранулярного ретикулума в клетках. По активности накопления в клетках ламинарных структур, митохондрий и мембран эндоплазматического ретикулума судят о степени патогенности штамма. При этом более высокая активность накопления названных структур свидетельствует о более высокой патогенности штамма. .Пример. У двух групп растений дурмана Datura stramonium Ь. (по пять растений в каждой группе) в возрасте 3-4 недель, выращенных в теплице, два нижних листа напыляли карборундом, при этом одну группу растений инокулировали соком листьев дурмана, пораженных сильнопатоген1 558986

25 ным штаммом, а другую - соком листьев дурмана, пораженных слабопато" генным штаммом Х-вируса картофеля.

Через 5 сут. готовили препараты для эЛектронномикроскопических наблюдений. Для этого. из верхних листьев размером около 7 см вырезали небольшие кусочки ткани, фиксировали их

3 ч в 6,5Х-ном растворе глутараль- 1{) дегида, приготовленном на фосфатном буфере (рН 7,4) и. 2 ч — в ) Ж"ной четырехокиси осмия, затем обезвожи" вали в спирте и ацетоне и заключали в аралдит. Из полученных от каждого f5 растения блоков готовили срезы, которые помещалн на однощелевые бленды и исследовали s электронном микроско пе УЗИВ-)00 АК.

Исследования показали, что в клет- 2р ках мезофилла листьев растений, зараженных как сильнопатогенным, так и слабопатогенным штаммом ХВК, происходит новообразование ламинариых структур, а также увеличение коли чества митохондрий и мембран агранулярного эндоплазматического ретикулума. Причем количество этих структур находится в прямой зависимости от степени патогенности штамма. За- висимость.мор@ометрических параметров клеток мезофилла листьев дур" мана от инфицирования их разными штаммами представлены в таблице.

Проведенный ультраструктурный анализ свидетельствует о том, что в клетках, пораженных сильнопатогенньи штаммом, накапливается значительно больше в сравнении с клетками, зараженными слабопатогенным 4р штаммом, ламинарных структур, митохондрий, мембран агранулярного эндо" плазматического ретикулума, В известном способе связь репродукции вирулентного штамма с дест- 45 рукцией хлоропластов не может служить надежным критерием степени патогенности штаммов, так как деструктивные изменения хлоропластов могут быть связаны не только с инфекцией, но и с рядом внешних факторов и прежде всего с дефицитом в почве минеральных элементов (азота, фосфора, калия, кальция и др.). Даже если выращивание растений, инфицированных разными штаммами, проводится в теплице в одинаковых условиях, недостаток какого-либо элемента в почве может вызывать деструктивные изменения хлоропластов, не связанные с заражением.. В таком случае оценить деструктивное воздействие вирусной инфекции на хлоропласты затруднительно .

В зараженных сильнопатогенным штаммом Х-вируса клетках растений в хлоропластах ХЛ (очень редко) образуются чашевидные инвагинации, в которых обнаруживаются клеточные компоненты: митохондрии, рибосомы, различные мембранные образования, Еще реже встречаются хлоропласты с чашевидными инвагинациями, в которых наблюдаются вирусные частицы.

При исследовании ультраструктуры клеток растений дурмана, пораженных сильнопатогенным штаммом ХВК, установлено, что вирус в инвагинациях был обнаружен лишь в шести случаях.

В остальных случаях в клетках инфицированных сильнопатогенным штаммом ХВК хлоропласты не имеют инвагинаций, клетки содержат относительно небольшое количество вирусных частиц и большое количество ХВК-индуцированных ламинарных структур ЛС в сравнении с клетками, инфицированными слабопатогенным штаммом ХВК.

Кроме того, под действием сильнопатогенного штамма ХВК в клетках формируется большое количество мембран эндоплазматического ретикулума и митохондрий по сравнению с клетками, инфицированными слабопатогенным штаммом.

В клетках, инфицированных слабопатогенным штаммом ХВК, также в очень редких случаях встречаются хлоропласты с чашевидными инвагинациями в том числе с инвагинациями, в которых обнаруживаются вирусные частицы.

В исследованных хлоропластах в клет" ках, зараженных слабопатогенным штаммом, обнаружено лишь две инвагинации с заключенными в них частицами ХВК.

Таким образом, вирусные частицы встречаются, хотя и очень редко, в инвагинацияххлоропластов клеток зараженных как сильнык, так и слабым штаммами ХВК. Следовательно этот признак — наличие вирусных частиц в инвагинациях хлоропластов - не может быть использован в качестве надежного критерия степени патогенности штаммов ХВК.

Признаком, отличающим клетки, зараженные слабопатогенньж штаммом

Параметры

Здоровый контроль

Штаммы ХВК

Сильнопато- . Слабопатогенный генный

Объемная плотность

ХВК-индуцированных ламинарных структур, Ж от объема клеток

6,7+0,7

15, 2 +1, 5

Число митохондрий в 100 мкмЗ

2,3+0,3

3,0+0,3

8,2+0,9

Поверхность мембран агранулярного эндоплазматического ретикулума в 1 мкм> мкм

2,2+0,3 1 37+0,2

7,5+0,8

Число профилей частиц ХВК в

1 мкм

82 й9,0

45+5,0

Составитель Т, Полянская

Техред И.Ходанич Корректор Н Король

Редактор Н. Яцола

Заказ 820 Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4!5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101

5 . 155

ХВК, являются накопление„в клетках относительно большого количества вирусных частиц и существенно менЬшего количества ламинарных структур митохондрн% и мембран агронулярного эндоплазматического ретикулизма, по сравнению с клетками,,инфицированными сильнопатогенным штаммом ХВК.

Способ относительной оценки степени интенсивности штаммов ХВК поз". воляет использовать защитные ответные реакции клеток на вирусное заражение, которые при одинаковых условиях выращивания зараженных разными штаммами растений будут зависеть лишь от вирусной инфекции. Установлено, что в клетках, зараженных снльнопатогенным штаммом ХВК, количество этих структур будет значительно больше, чем в клетках, зараженных слабопатогенньи штаммом.

8986 6

Формула изобретения

Способ относительной оценки степени патогенности штаммов Х-вируса картофеля, включающий зара®ение растения-индикатора исследуемыми атаммами с последующим ультраструктурньм сравнительньи анализом клеток инфицированных листьев растения-индикатора и оценкой степени патогенности, отличающийся тем, что, с целью повышения достоверности cIlo» соба, ультраструктурному анализу подвергают индуцированные Х-вирусом картофеля ламинарные структуры, митохондрии и мембраны агранулярного эндоплазматического ретикулума, определяют их количество, а оценку степени патогенности осуществляют по количеству ультраструктур, прн этом к более патогенном штаммам относят штаммы, под действием которых в клетках образуется большее ,количество ультраструктур.