Способ определения минимальной подавляющей концентрации антибиотика
Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к клинико-лабораторным методам исследований. Цель изобретения - повышение точности способа, а также увеличение сроков хранения готовых планшетов. Питательная среда содержит следующее соотношение компонентов, мас.%: ферментолизат биомассы микроорганизмов 1-1,3 глюкоза 0,1-0,5 фосфат натрия двузамещенный 0,29-0,32 хлористый трифенилтетразолий 0,07-0,14 альгинат натрия 0,15-0,3 дистиллированная вода остальное. Готовят двукратные разведения антибиотика и полученные разведения вносят в лунки титрационного планшета. После этого планшеты лиофилизируют. При дальнейшем использовании в лунки вносят суспензию микроорганизмов и инкубируют. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика определяют визуально по изменению темно-вишневого цвета среды. Первая лунка, в которой среда обесцвечивается, соответствует МПК антибиотика. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСН ИХ
РЕСПУБЛИН
Щ) 5 С 12 1/04
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ
ll0 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4428713/30-13 (22) 18.05.88 (46) 15.07.90. Бюл. Ф 26 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков (72) Б.M.Áåêáåðãåíoâ, О.Н.Сперанская, С.П.Резван и П.С,Навашин (53) 615.779 ° 9(088.8} (56) ТУ 59.045.62-86:
Brinkmann J, Kin neues Mikrosystem. Mikrobiologie (Labor Praxis in
der. Nedizin) 1981, U, р ° 28-31. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИНИМАЛЬНОЙ
ПОДАВЛЯЮЩЕЙ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИБИОТИКА (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к клинико-лабораторным методам исследований. Цель изобретения — повышение точности способа,а также увеличение сроков хранения готовых планшетов.
Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к клинико-лабораторным методам исследований.
Цель изобретения — повышение точности способа, а также увеличение сроков хранения готовых планшетов.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Готовят питательную среду следующего состава, мас.X: ферментолизат биомассы микроорганизмов (осветленный) 1,2
Глюкоза 0,3
„„SU 1578197 А 1
Питательная среда содержит следующее соотношение компонентов, мас.X: ферментолизат биомассы микроорганизмов
1-1,3; глюкоза О, 1-0 5 фосфат натрия двузамещенный 0,29-0,32; трифенилтетраэолий хлористый 0,07-0, 14; альгинат натрия 0,15-0,3; дистиллированная вода остальное. Готовят двукратные разведения антибиотика и полученные разведения вносят в лунки титрационного планшета. После этого планшеты лиофилиэируют. При дальнейшем использовании в лунки вноСят суспенэию микроорганизмов и инкубируют. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотика определяют визуально по изменению темно-вишневого цвета среды. Первая лунка, в которой среда обесцвечивается, соответствует МПК антибиотика. 1 э.п. ф-лы, 2 табл.
Двуэамещенный натрия фосфат 0,3
Хлористый трифенилтетраэолий 0,1
Альгинат натрия 0,2
Дистиллированная вода Остальное
В дистиллированной воде растворяют 1,2 г ферментолизата биомассы микроорганизмов, 0,3 г глюкозы и
0,3 г натрия фосфата двузамещенного, тщательно перемешивают, доводят рН до 8,0-8,2 20X NaOH, затем кипятят в течение 5 мин и фильтруют, через бумажный фильтр. Устанавливают рН среды 7,6 концентрированным раство1578197 ром НС1. Стерилизуют при 121 С в течение 15 мин.
Готовую среду разливают до 30 мл ( в 96 стерильных мерных колб емкостью
100 мл.
Для раститровки одного антибиотика требуется 8 колб — 8 разведений.
Б первой колбе — максимальная концентрация антибиотика (например, для
10 бензилпенициллина она равна 32 мкг/мл).
Колбу встряхивают до полного растворения и равномерного распределения антибиотика в среде. Затем HoJIOBHHó
Содержимого первой колбы переносят
8о вторую колбу с питательной средой — в этой колбе концентрация антибиотика в два раза меньше, чем в первой колбе (для бенэилпенициллина это 16 мкг/мл). Вторую колбу встряхивают и снова, половину ее содержимого переносят в третью колбу, где концентрация препарата в два раза меньше, чем во второй колбе (для бен.зилпенициллина — 8 мкг/мл). Таким образом готовят все восемь разведений одного антибиотика, а затем готовят разведения остальных антибиотиков.
Выбранные концентрации антибиотиков представлены в табл. 1.
После раститровки всех антибиотиков в лунки планшета с круглым дном вносят по 0,1 мл раствора каждого антибиотика в таком порядке, что первая лунка каждого из 12-ти рядов содержит максимальную концентрацию препарата, а далее следуют двукратноубывающие концентрации антибиотиков ° Например, ряд с бензилпенициллином выглядит так: первая лунка 32 мкг/мл, вторая лунка
16 мкг/мл, третья лунка 8 мкг/мп, четвертая лунка 4 мкгlмл, пятая лунка
2 мкг/мл, шестая лунка 1 мкг/мл, седьмая лунка 0,5 мкг/мл, восьмая лунка
0,25 мкг/мл.
Заполненные планшеты помещаются в холодильную камеру, где постепенно понижают температуру до -40 С. Замоо раживание продолжают в течение 12 ч, После этого в холодильной камере устанавливают общее давление менее
100 мм рт.ст. повышают температуру на 10 С и выдерживают планшеты 40—
50 мин, Затем постепенно поввпиают температуру на 30 С, а когда планшеты нагреваются, поднимают температуру до 40 С. Планшеты выдерживают в этих условиях в течение 4 ч. За это
Пример 3. Питательную среду готовят по следующей прописи, мас.Ж:
Ферментолизат биомассы микроорганизмов (осветленный) 1,3 время содержимое лунок полностью высыхает, образуя за счет альгината натрия тонко дисперсный осадок в виде застывшей пены, прочно скрепленный с дном и стенками лунок.
Иэ эталонной культуры Escherichia
coli ATCC 25922 в пробирке с дистиллированной водой стерильно готовят суспензию, соответствующую 5 ЕД по оптическому стандарту мутности, Инокулят в объеме 0,1 мл вносят в каждую лунку приготовленной системы с помощью пипеточного дозатора. Планшеты помещают в термостат и инкубируют при 37 С в течение 18 ч.
Оценку результатов исследования проводят визуально по изменению окраски от темно-вишневого до образования прозрачной среды беэ окрашивания, Концентрация антибиотика в последней лунке с .задержкой роста в ряду разведений антибиотика — прозрачная среда, без темно-вишневого окрашивания., соответствует значению мини" мальной подавляющей концентрации (MIIK) данного антибиотика в отношении использованного эталонного штамма E. coli АТСС 25922. Установлено полное совпадение результатов по уровням ИПК для всех 12 антибиотиков.
Пример 2. Питательную среду готовят в соответствии с примером 1 по следующей прописи, мас.7:
Ферментолизат биомассы микроорганизмов (осветленный) 1,0
Глюкоза 0,1
Двуэамещенный натрия фосфат 0,29
Хлористый трифенилтетразолий 0,07
Альгинат натрия 0,15
Дистиллированная вода Остальное рН после стерилизации 7,2-7,4.
Далее ход приготовления лиофилизированной системы микроразведений и способ определения ИПК изученных антибиотиков для штамма E. coli АТСС 25922 аналогичен примеру 1.
Установлено полное совпадение результатов по уровням MIIK для всех изученных антибиотиков.
15781
0,5
1О
0,29-0,32
Таблица 1
32,0-0,25
32,0-0,25
32,0-0,25
512,0-4,0
t28 0-1,0
128,0-1,0
32,0-0,25
32,0-0,25
128,0 — 1,0
64,0-0 5
32,0-0,25
Бензилпенициллин
Оксациллин
Ампициллин
Карбенициллин
Цефалотин
Канамицин
Гентамицин
Амикацин
Полимиксин
Тетрациклин
Эритромицин
1люкоза
Двузамещенный натрия фосфат 0,3?
Хлористый трифенилтетразолий 0,14
Альгинат натрия 0,3
Дистиллированная вода Остальное рН после стерилизации 7,2-7,4.
Далее ход приготовления лиофилизированной системы микроразведений и способ определения МПК изученных антибиотиков для штамма Е coli ATCC
25922 аналогичен примеру i °
Установлено полное совпадение результатов по уровням МПК для всех изученных антибиотиков.
В табл. 2 представлены результаты определения MIIK. 20
В табл. 2 представлены результаты определения МПК некоторых антибиотиков в отношении трех эталонных культур
Staphylococcus aureus ЛТСС 25923, Е. coli ATCC 25922 и Pseudomonas 25
aeruginosa ATCC 27853. Для них известны значения МПК выбранных антибиотиков, которые приведены в табл. 2 (для каждой культуры — правый столбец цифр). В левом столбце приведены результаты определения МПК тех же антибиотиков, полученные с помощью известного способа и с помощью полуавтоматической системы MIC-2000 известный).
Как видно из табл. 2, модифицированный способ определения МПК антибиотиков позволяет значительно более точно определять уровни антибиотикочувствительности.
Использование способа позволяет повысить точность определения, упростить и ускорить его эа счет использования предварительно заготовленных и лиофилизированных планшетов, которые могут храниться без потери актив45 ности антибиотиков в течение 12 мес. при 4 С.
Формула изобретения
1. Способ определения минимальной подавляющей концентрации антибиотика путем приготовления двукратных серийных разведений антибиотика в питательной среде, содержащей источник азота, 97 6 соль натрия, фосфат и дистиллированную воду, с последующим заполнением лунок титрационного планшета приготовленными разведениями, внесением в них суспензии микроорганизмов, инкубированием посевов и учетов результатов, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, питательная среда дополнительно содержит глюкозу и хлористый трифенилтетразолий, в качестве источника азота — ферментолизат биомассы микроорганизмов, в качестве соли натрия— альгинат натрия, в качестве фосфата двузамещенный фосфат натрия при следующем соотношении компонентов, мас.7:
Ферментолиэат биомассы микроорганизмов 1,0-1, 3
Глюкоза О, 1-0,5
Двузамещенный фосфат натрия
Хлористый трифенилтетразолий 0,07-0, 14
Лльгинат натрия 0,15-0,3
Дистиллированная вода Остальное и учет результатов проводят по изменению цветности среды. !
2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения сроков хранения готовых планшетов, планшеты после заполнения лунок средой с антибиотиком лиофильно высушивают.
Антибиотики Область двукратных разведений в мкг/мл
1578 197
1 }с о о л л
I
1 !
1 О
0 0
° л >,С>
С4 о л (0 о о о л л л (>O (Ч м I м
° «c tn 1
1 i-> cv I
I о
I v u ! и
° }-с ! сс! 4 1
0 л
>О}с
О 0 О л л л
С> л
СЧ
О> л
С>
O 0 л л 3 СЧ
С> 07 О 1
Î0Î О О «00000eeV л «Я л л О. > л л л л л л л
М - СО - СО СО (О М О 0 оо л л чф
1 1 4 с» I
1 Я „-3 I
Н м} I
".1 м 1 сс} с>
О \ с» с 4 1
=1 I
u u и о о1 о о
1 т" ("а 1
1 с.>
1 с>>
}с СЧ о л л л о - о
О > м л
СЧ
О >
« л о о о м л
С>
О л ь
СЧЮ МО1 Л ОСЧСЧ
- О e e Ю О М О М CV — О> л л л л л л л л л л л «л л л л оомоооо оо-ооооо
1
М
1 х
М М о у о
1 1
Э>ХЭ> 1 1
1 Й Й
Э tU с>} 1
Ц с>
Э
Э Ю а с»
И Ж
Ф
Э 5 Э (с> Э }с>
m ас>
И Р Ж
cd
}" х
I м I
cc}
1„" сс}
1
I
I Х
}4 х о х
Э а м о и СО
° лс с>с> м
Н 0
Э <.3
cd 1-> сб
Р ооооо 0 С>
«л л л л о -о с>о ("4 К > 4, ) } л (сД л «л > ) Ц;) л О со с > <ч о со
1„
I з
Х
1 4 х
1 о с
1 & и и
1 сб
1 а
Л
1 Ф
