Способ определения активности дегидрогеназ в лимфоцитах

 

Способ определения активности дегидрогеназ в лимороцитах относится к области медицины, а именно гематологии. Целью изобретения является повышение точности способа за счет более полного выявления активности дегидрогеназ. Активность дегидрогеназ определяется цитохимическим методом с использованием инкубационной среды, содержащей п-нитротетразолиевый фиолетовый, субстрат окисления, фосфатный буфер, этилендиаминтетраацетат и сывороточный альбумин, конечная концентрация альбумина 5%. Использование сывороточного альбумина как компонента инкубационной среды способствует удержанию клеток на предметном стекле и сохранению их формы без предварительной фиксации мазка, а также связывает жирные кислоты крови, ингибирующие дегидрогеназы. Одновременно обеспечивается ускорение способа.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ . РЕСПУБЛИК

119) (11) (51}5 G 01 Н 33/68 33/50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н A BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ iHHT СССР (21) 4391130/28-14 (22} 09.03.88 (46) 30.03.90. Бюл. 11 12 (71) Свердловский научно-исследовательский институт курортологии и физиотерапии (72) С.Е.Иощенко и В.С.Войтенок (53) 612.015(088.8) (56) Архив анатомии, гистологии и эмбриологии, 1969, Р 5, с. 85-91. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ДЕГИДРОГЕНАЗ В ЛИМФОЦИТАХ (57} Способ определения активности дегидрогеназ в лимфоцитах относится к области медицины, а именно к гематологии. Целью изобретения является повьппение точности способа за счет

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии и предназначено для цитохимического определения активности дегидрогеназ лимфоцитов.

Цель изобретения — повышение точности способа за счет более полного выявления активности дегидрогеназ при одновременном ускорении способа путем исключения. фиксации мазков крови перед инкубацией за счет того, что инкубация проводится в среде, содержащей альбумин, который способствует удержанию клеток на предметном стекле и сохранению их формы, а также связыванию жирных кислот, ингибирующих дегидрогеназы.

Способ осуществляется следующим образом.

2 более полного выявления активности дегидрогеназ. Активность дегидрогеназ определяется цитохимическим методом с использованием инкубационной среды, содержащей и-нитротетразолиевьп". фиолетовый, субстрат окисления, фосфатньп буфер, этилендиаминтетраацетат и сывороточный альбумин,конечная концентрация альбумина 5Х. Использование сывороточного альбумина как компонента инкубационной среды способствует удержанию клеток на предметном стекле и сохранению их формы без предварительной фиксации мазка, а также связывает жирные кислоты крови, ингибирующие дегидрогеназы. Одновременно обеспечивается ускорение способа.

1 табл.

Свежеприготовленные и высушенные при комнатной температуре в течение

30 мин мазки крови инкубируют во влажной камере при 37 С в течение 60 мин со средой следующего состава: и-нитротетразолиевый фиолетовый 0,25 мг/мп, субстрат соответствующей дегидрогена-зы О,1 моль/л с коферментом (1 мг/мл), если он необходим для окисления субстрата, фосфатный буфер 0,07 моль/л (рК 7,2), этилендиаминтетраацетат

0,5 ммоль/л, сывороточный альбумин

5 мг/мп. После инкубации мазок крови сушат при комнатной температуре, фиксируют в парах формалина 30 мин, ополаскивают дистиллированной водой и докрашивают краской Романовского (1 капля на 2 мп дистиллированной во3 1553 ды) в течение 10-15 мин. Иикроскопи1 рование проводят с масляной иммерсионной средой. Подсчитывают в клетках крови образовавшиеся гранулы фориазана, по количеству которых судят об активности дегидрогеназ.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в расширении диапазона выявления активности фермента (что

1.9 позволяет отметить более тонкие градации метаболического состояния клеток крови в условиях нормы и патологии), существенном уменьшении доли клеток с нулевой активностью фермен15 та и сокращении общего времени приготовления препарата до 3-3,5 ч.

При определении активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов периферической крови предложенным спосооом встречаются клетки, с одержащие от 1 до бО и более гранул. формазана, при,чем активность ферментов выявляется в

97-99Z лимфоцитов, в отличие от известного способа, по которому содер- 75 жание лимфоцитов с нулевой активностью значительно (около чОЕ) .

Пример . Определение активности сукцинатдегидрогеназы.

Испытания проведены на 20 белых беспородных крысах массой 200-230 г.

Кровь получали путем пункции хвостовой вены. Готовили по 4 мазка крови от каждой крысы, один из которых обрабатывали предложенным способом, 35 второй — без субстрата окисления в среде инкубации (контроль), третий— па способу-прототипу, четвертый — по прототипу, но без субстрата окисления в среде инкубации (контроль).

Приготовление препарата предложенным способом производилось в следующей последовательности.

Свежеприготовленные мазки крови сушили при комнатной температуре 30 мин.45

Далее предметные стекла с мазками помещали во влажную камеру, поверх мазка наливали 0,8 мп инкубационной среды следующего состава: и-нитратетразолиевый фиолетовый О 25 мг/мл сукциУ 9

50 нат натрия 0,1 моль/л, фосфатный буфер 0,07 моль/л (рН 7,2), этилендиаминтетраацетат 0,5 ммоль/л . Контрольное исследование проводили с инкубационной средой того же состава, но без сукцината. Инкубацию проводили в теро мостате при 37 С бО мин. Затем мазки извлекали из термостата, высушивали при комнатной температуре под струей воздуха ат вентилятора, проводили фиксацию мазков в парах. формалина 30 мин, ополаскивали дистиллированной водой, сушили и докрашивали разведенной краской Романовского (1 капля на

2 ил дистиллированной воды) 10 мин.

Приготовление препарата по методике прототипа проводили следующим образом.

Свежеприготовленные мазки крови сушили при комнатной температуре 2 ч.

Далее мазки фиксировали в холодном

60Х-ном ацетоне, насьпценном этилендиаминтетраацетатом, в течение 30 с, промывали дистиллированной водой, высушивали на воздухе и инкубировали во влажной камере при 37 С бО мин со средой следующего состава: и-нитротетразолиевый фиолетовый 0,25мгlмп, сукцинат натрия О, 1 моль/л, фосфатный буфер 0,07/ моль/л (рН 7,2), этилендиаминтетраацетат 0 5 моль/л. После инкубации мазок промывали дистиллированной водой, проводили дополнительную фиксацию в парах формалина 30 мин, промывали дистиллированной водой, сушили и докрашивали 0,57.-ным раствором метиленового зеленого на ацетатном буфере (pH 5,0) в течение 10.мнн.

Иикроскопировали высушенные мазки нод масляной иммерсией при увеличении

12х1,25x100. Подсчитывали количество образовавшихся гранул формазана в

50 лимфоцитах.

Результаты испытаний показали, чта в обеих контрольных пробах (без субстрата окисления) гранулы формазана в клетках, KcLK правило, не образовывались, редко — одна-две.

Статическая обработка результатов проведена при помощи парного критерия

Вилкоксона.

Результаты испытаний представлены в таблице.

Ф о р м у л а и з обретения

Способ определения активности дегидрогеназ в лимфоцитах путем приготовления мазков крови, инкубации их в среде, содержащей буферный раствор, субстрат окисления, этилендиамннтетраацетат и и-нитротетразолиевый фиолетовый с последующим высушиванием мазков и подсчетом гранул формазана в лимфоцитах под MBKpocKolroM о т— л и ч а ю шийся тем, что„ с це5 1553903 6 лью повышения точности способа эа счет нии способа, в среду инкубации допол; более полного выявления aKTHBHoctH нительно вводят сывороточный альбумий

;дегидрогеназ при одновременном ускоре- в " HíeHTÐàèèH 5 мг/мп.

Характеристика Прототип редлагамый способ

Среднее количество гранул формаэа" на на 1 лимфоцит

Содержание лиитто". цнтов с нулевой активностью фермента, Ж

Продолжительность приготовления препарата, ч

О, 001

0,001

2,5

4,5

Составитель Н. Гуляева

Редактор Л.Пчолинская Техред Л. Сердюкова Корректор Н.Ревская

Заказ 454 Тираж 523 Подпис ное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж»35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101