Способ определения активности карбоангидразы

 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам определения дегидратирующей активности карбоангидразы (КА), и может быть использовано в биотехнологии, физиологии растений и медицине. Цель изобретения - повышение чувствительности способа. Активность КА измеряют электрометрически, по изменению PH в ходе реакции дегидратации углекислоты. Система для определения активности КА включает высокочувствительный PH-метр, самописец и компенсатор, обеспечивающий соответствие всей шкалы PH-метра 0,05-0,2 ед. PH. Реакцию дегидратации углекислоты проводят в 20 мл 0,002-0,03 М (или имидозольного, или вероналового) буфера со значением PH 6,8-7,2. Реакцию инициируют быстрым введением раствора субстрата - бикарбоната натрия (1-100мМ) в реакционную смесь, содержащую исследуемый образец. При этом происходит увеличение PH на 0,01-0,05 ед. Регистрируется время, за которое происходит сдвиг PH на 0,01 ед. Параллельно проводятся измерения с инактивированным образцом и рассчитывают активность по формуле, приведенной в описании.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИМИСТИЧЕСНИК

РЕСГ1УБЛИ К

ОсП (11) ПЦ С г 1/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

re ИЗОЫРЕТЕНИЯМ И 0ТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

Н АВТОРСНОМУ СвйДЕТЕЛЬСТВУ

{ 21 ) 41 23663/28-1 4 (22) 23.09.86 (46) 15.08.90. Бюл, У 30 (71) Институт биохимии им. А.Н.Баха (72) Ю.М.Комарова и Н.Г.Доман

{53) 612.015(088.8) (56) Enzymologia, 1940, Bd. 6,,ti- 1-3, 1! 3-! 28.

{54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

КАРБОАНГИДРАЗЫ (57) Изобретение относится к биохимии, а именно к способу определения дегидратирующей активности карбоангидраэы (КА), и может быть использовано в биотехнологии, физиологии растений,и медицине. Цель изобретения — повьппение чувствительности способа. Активность КА измеряют электрометрически, по изменению рН в ходе реакции дегидратации углекисИзобретение относится к биохимии, а именно к способу определения дегидратирующей активности карбоангидразы (КА), и может быть использовано в биотехнологии, физиологии растений, а также в медицине в диагностических целях.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа, достигается тем, что определение активности фермента осуществляют электрометрически, регистрируя время образования продукта реакции по изменению рН иа

О, 05-0, 01 ед. в растворе с буферной емкостью 0,002-0,01 М и концентрацией бикарбоиата 1-100 мМ.

2 лоты. Система для определения актив- нос -.". - А включает высокочувствительный рН-метр, самописец и компенсатор, обеспечивающий соответствие всей шкалы рН-метра 0,05-0,2 ед. рН. Реакцию дегидратации углекислоты проводят в 20 мл 0,002-0,03 М или имидазольного, или вероналового буфера со значением рН 6,8-7,2. Реакцию инициируют быстрым введением раствора субстрата — бикарбоната натрия (1-100 мМ) в реакционную смесь, содержащую исследуемый образец. При этом происходит увеличение рН на

0,01-0,05 ед. Регистрируется время, за которое происходит сдвиг рН на

0,01 ед. Параллельно проводят измерения с инактивированным образцом v. рассчитывают активность по формуле, приведенной в описании.

Пример 1. Для определения активности КА н реакции дегидратации углекислоты используют электрометрическую систему, В реакционную ячейку наливают 20 мл 0,002 M фосфатного буфера, рН 7,0, содержащего 0,1 мкг гомогенной КА, выделенной из листьев бобов (II), и 0,001 M L-меркаптоэтанола, Реакционную смесь перемешивают и термостатируют до установления посо тоянного рН и температуры (2 С) и течение 5 мин. Реакцию начинают введением 1 мМ (О,1 мл 0,2 М раствора) бикарбоната натрия при непрерывном перемешивании. Самописец вычерчивает кривую изменения рН но времени. Регистриру1585333 ют время изменения рН на 0,01 ед. (t„>, после чего самописец выключают. Реакционную смесь после заве.ршения реакции выпивают, ячейку неоднократно промывают спиртом и бидистиллированной водой. Контроль или время некатализируемой реакции (t ) дегидратации бикарбоната измеряют аналогично определению t„, однако реакционную смесь предварительно кипятят 3 мин на водяной бане и затем охлаждают до 2РС, Полученные ,значения t „ = 10 с и to = 20 с подt o — tx1 ставляют в формулу: А = ---- — -тамг

t„ белка, и, таким образом, получают величину активности КА, выраженную в условных единицах. Для расчета истинной дегидратирующей активности

КА-А1 необходимо знать значения ско ростей катализируемой (V ) и некатаk лиэируемой (Чр) реакций, что связано с определением точных концентраций водородных ионов LH j gи Н 1, ко 25 торые вовлекаются в процесс дегидратации НСО -ионов. Для этого проводят титрование реакционной смеси, состоящей из всех компонентов, используемых для определения А, за исключением субстрата. Вместо субстрата в реакционную смесь добавляют 0,01-0,05 н, БаОН до получения соответствующего сдвига рН. С учетом времени (t . и

t<) эа которое происходят эти сдви35 ги рН в процессе реакции, определя(Н Э ют значения скоростей V „= — — — и

t Н 3

О с

О 40

Конечный результат — активность

КА находят из разности скоростей (V„-. V()), соотнесенной к количеству белка (мг белка) в реакционной смеси:

Ч к Vo

А = — — — --- и выражают в мкМ де- 45 мг белка гидратированного бикарбоната эа 1 мин

1 мг белка (мкМ HCO>/мин мг белка) .

Окончательное значение А,, полученное в результате данного измерения, равно 7,5+ 0,075 мкН/мин мг белка.

П р н м е р 2. Ход определения активности КА аналогичен примеру 1, однако в качестве источника фермен55 та используют 0,2 мл донорской крови человека, содержащей 0,2.мг белка разведением водой 1:400000, а реакцию начинают введением 5 мМ (0,5 мл

0,2 M раствора) бикарбоната натрия в имидозольный буфер с рН 7,1 и буферной емкостью 0,009 М. На экспериментальной кинетической кривой, записанной потенциометром .самописцем, фиксируют сдвиг рН, равный 0,02 ед., и определяют соответствующее ему время реакции: t „= 18 с. Аналогичным образом измеряют время контроля t =

= 34 с. С использованием полученных значений ЧК и V0 и учетом количества белка в реакционной смеси рассчитывают А = (4, 5 + О, 05) ед, /мг белка.

Для определения истинного значения активности КА-А определяют точную

1 концентрацию протонов (Н ), соответствующую сдвигу рН 0,02 ед. Для этого реакционную смесь того же состава, как и использованную для нахождения А, титруют добавлением 0,02 мл

0,01 í. NaOH. Полученная СН 3 б

10 к 10 М; соотнеся ее ко времени

t< и t<, рассчитывают соответственно

Ч „= 18,8 х10 М/мин и Чр = 8,8

-Е

*10 M/ìèí, Принимая во внимание кон" центрацию белка в реакционной смеси (О, 2 мг), по формуле для нахождения

А1 определяют ее значение А (70 0,7) 10 М/мин мг белка. формула изобретения

Способ определения активности карбоангидразы путем добавления исследуемого образца к субстратно-буферной смеси и регистрации времени образования продукта реакции при параллель ном п ров едении тех же оп е раций с инактивированным образцом, последующим расчетом активности, о т личающийс я тем, что, сцелью повьппения чувствительности способа, используют буферный раствор с рН 7,0-7,2 и буферной емкостью

0,002-0,03 М, концентрацию бикарбоната натрия 1-100 мМ, при этом о времени образования продукта реакции судят по времени изменения рН на 0,05-, 0,01 ед.