Штамм бактерий bacillus subtilis продуцент белка а staphylococcus aureus

 

Изобретение относится к биотехнологии. Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта за счет повышения его удельной активности. Штамм B. subtilis LPM 15 продуцент белка А S. aureus получен трансформацией B. subtilis AU 73 рекомбинантной плазмидой рММ 9. Штамм депонирован по Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ под номером GR-303 Д. Штамм секретирует гомогенный белок А во внеклеточную среду в количестве 100 мг на 1 л среды с удельной активностью 10 12 мг LgG на 1 мг белка А.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм Bacillus subtilis продуцент белка А. Целью изобретения является улучшение качества целевого продукта за счет повышения его удельной активности. Штамм бактерий Bacillus subtilis характеризуется следующими свойствами. Морфологические признаки. Клетки прямые, палочкообразной формы, размером 0,7-0,8х2-3 мкм, подвижные, грамположительные, спорообразующие, расположение спор центральное. Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на мясопептонном агаре и агаризованной среде LB колонии круглые с ровным краем, могут диссоциировать на R- и S-формы. При росте в жидких средах мясопептонном бульоне, среде LB образуют ровную, интенсивную муть. Физиолого-биохимические признаки. Клетки растут при 5-50^оС, могут расти при рН 5,7 и 7%-ной концентрации NaCl. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты и, в частности, глюкозу, арабинозу, ксилозу, маннит, цитрат. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и органические формы в виде аминокислот и пептидов. Нитраты восстанавливает до нитритов. Крахмал не гидролизует. Расщепляет казеин. Не гидролизует гиппурат. При росте на цитратно-солевом агаре образует щелочь. Устойчивость к антибиотикам. Проявляет признаки устойчивости к канамицину и хлорамфениколу, обусловленные наличием плазмиды рММ 9. Продуктивность штамма. Штамм IPM-15 продуцирует 100 мг белка А на 1 л культуральной жидкости, при удельной активности 10-12 мг IgG/1 мг белка А. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером CR-303 Д. П р и м е р. Получение штамма IPM-15. ДНК плазмиды рММ 9 выделяют по методу Birnboim H.C. Doly J. (Nucl. Acids Res. 1979, 7, 1513-1523) с последующей очисткой в градиенте CsCl в присутствии бромистого этидия. Клетки B.subtilis IPM-12, содержащие плазмиду рММ 9, выращивают в 0,5 л среды LB (триптон 10 г, дрожжевой экстракт 5 г, NaCl 5 г, вода 1 л) до поздней логарифмической фазы роста, осаждают центрифугированием (5000 g, 10 мин) и суспендируют в 20 мл раствора К (25 ммоль трис-НСl), рН 8,0, 10 ммоль ЭДТА, 50 ммоль глюкозы, лизоцим 10 мг/мл). Суспензию инкубируют 30 мин при 0-2^оС, прибавляют 40 мл раствора В (0,2 н.NaOH, 1%-ный додецилсульфат натрия) и тщательно перемешивают. Затем в лизат вносят 0,30 мл 3М ацетата натрия, рН 4,8, перемешивают, выдерживают 1 ч при 2-4^оС и центрифугируют (2000 g, 10 мин). К супернатанту добавляют 1 объем этанола и выдерживают 2 ч при 0^оС. Осадок ДНК собирают центрифугированием (5000 g, 10 мин) и растворяют в 8 мл ТЕ (50 ммоль трис-НСl, рН 8,0, 5 ммоль ЭДТА). К раствору добавляют 8,8 г СsCl и 300 мкл раствора бромистого этидия (10 мг/мл) и центрифугируют (4000 об/мин, 40 ч). Полосу, соответствующую плазмидной ДНК, отбирают, освобождаются от бромистого этидия экстракцией изоаминовым спиртом, добавляют равный объем воды. ДНК осаждают добавлением двукратного объема этанола и осадок растворяют в 10 мМ трис-НСl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5. Выделенную плазмидную ДНК используют для трансформации компетентных клеток B.subtilis AI 73 (apr^-, npr^-, amy^-). Компетентные клетки этого штамма получают следующим образом. 0,5 мл ночной культуры А173, выращенной в среде Спицейзена I, содержащей (NH₄)₂SO₄ 2г; КН₂РО₄ 10 г; К₂НРО₄ 14 г; цитрат натрия 1 г; MgSO₄ 0,2 г; глюкозу 5 г; дрожжевой экстракт 0,1 г; гидролизат казеина, триптофан и треонин по 40 мг, воду 1 л, при 28^оС, вносят в пробирку с 10 мл той же среды и проводят инкубацию при 37^оС в течение 4 ч при постоянном встряхивании, культуру разводят в 7 раз средой Спицейзена II, содержащей (NH₄)₂SO₄ 2 г; КН₂РО₄ 10 г; К₂НРО₄ 14 г; цитрат натрия 1 г, глюкозу 5 г; MgSO₄ 1 г, казаминовые кислоты 0,5 г; воду 1 л, и выращивают 50 мин при 37^оС. Для трансформации к 0,2 мл этой культуры добавляют 50 мкл раствора ДНК (0,4 мкг/мкл), инкубируют в течение 30 мин при 37^оС, добавляют 1 мл среды LB, растят 2 ч при 37^оС и соответствующие разведения культуры высевают на агаризованную среду LB, содержащую хлорамфеникол и канамицин (по 10 мкг/мл) и иммуноглобулины человека (1 мг/мл). Клоны, выросшие на такой среде и дающие зону преципитации, отбирают. Один из клонов обозначен как штамм B.subtilis IPM-15. Стабильность поддержания плазмиды рММ 9 определяют после выращивания культуры в течение 100 генераций в неселективных условиях, рассева культуры до отдельных колоний и анализа 500 клонов каждой культуры на маркеры этой плазмиды. Частота утраты штаммом B.subtilis IPM-15 плазмиды рММ 9 составляет не более 10^-4. Штамм B.subtilis IPM-15, продуцирующий белок A S. aureus, обладает следующими полезными свойствами: штамм IPM-15 непатогенен; клетки штамма IPM-15 секретируют белок А в большом количестве во внеклеточную среду; удельная активность продуцируемого белка составляет 10-12 мг IgG на 1 мг белка А.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКМ N CR-303 Д продуцент белка А Staphylococcus aureus.