Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l., продуцирующий моноклональные антитела к бактериям рода brucella
Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине при диагностике бруцеллеза. Цель изобретения - получение гибридомы - продуцента монАТ, пригодных для дифференциации бактерий рода BRUCELLA и не дающих перекрестных реакций с бактериями YERSINIA ENTEROCOLITICA серовара 0:9. Штамм БАМА депонирован под номером ВСКК(П)302Д. Штамм сохраняет продуцирующую способность в течение 5 пассажей на сингенных мышах. Выход монАТ на 3-4 день культивирования в среде составляет 35-45 мкг/мл, IN VIVO - 8 мг/мл асцитной жидкости. Продуцируемые штаммом монАТ относятся к классу JGG, подклассу 2а специфичны к эпитопу "кор" части полисахаридной цепи ЛПС бруцелл. 1 табл.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К. A ВТОРСНОЬЮ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPblTHRM
ПРИ ГННТ СССР (21) 464568 1/30-13 (22) 30.12.88 (46) 07.11.90. Бюл. У 4 1 (71) Целиноградский сельскохозяйственный институт„ Институт биоорганической химии им, M.М. Шемякина и Всесоюзный научно-исследовательский институт зкспериментальной ве— теринарии им. Я.P. Коваленко (72) А.К. Булашев, В.А. Несмеянов, А.Ф. Дмитриев, К.К. Муканов, Т.Г. Байтубаев, В.А. Ромахов и А.Н. Касьянов (53) 678. 085. 23 (088,8) (56) Roop R,М., Praston — Moore D., Bagchi Т., Schurig С, Rapid identification of smooth .Brucella species zith a monoclonal antibody. — J.
Clinical Microbiology, 1987, v. 25, Р 11, р. 2090-2093. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕЫ 1Х клеток животных ыю8 м08сиьня
Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине при диагностике бруцеллеза, Целью изобретения является получение гибридомы-продуцента монАТ, пригодных для дифференциации бактерий рода Brucella и не дающих перекрестных реакций с бактериями Yersinia
entегоcolitica серовара О:9.
Штамм гибридомы получают следующим образом.
ÄÄSUÄ 1604849 А 1 (51)5 С 12 И 5/00 С l2 Р 21/08
ПРОДУЦИРУ"0ШИИ МОНОКЛОНАЛЬНЬБ АНТИТЕЛА . К БАКТЕРИЯМ РОДА ВНГСЕЬ1,А (57) Изобретение относится к гибрид омной технологии и может быть использовано в ветеринарии и медицине при диагностике бруцеллеза. Цель изобретения — получение гибридомы —. продуцента монАТ, пригодных для дифференциации бактерий рода Brucella и не дающих перекрестпых реакций с бактериями Yersinia entегоcolitica серовара 0:9. Штамм БАМА депонирован под номером ВСКК(П) 302Д. Штамм сохраняет продуцирующую способность в течение 5 пассажей на сингенных мышах. Выход монАТ на 3-4 день культивирования в среде составляет 3545 мкг/мл, in vivo — 8 мг/мл асцитной жидкости. Продуцируемые штаммом
1 монАТ относятся к классу Igg под-. С„ классу 2а; специфичны к зпитопу "кор" ча.сти полисахаридной цепи ЛПС бруцелл .
Мышам линии BALB/ñ в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят полисахаридный антиген. — поли-Б, по-, лученный из R-форм Brucella m&litensis B115 в дозе 30 мкг в 0,1 мл неполного адъюванта Фрейнда. Поли-Б из k-форм бруцелл не содержит Оантигена ЛПС и состоит из липида А и сердцевинной ("кор") части бактери-. ального полисахарида. На 7, 11, 12 и 13 дни иммунизации животным инъецируют пс 15 мкг антигена в забу1604849 ференном физиологическом растворе (ЗФР) . Спустя 4 дня после последней инъекции, извлекают селезенку тех мышей, которые дают более высокие титры антител к поли-Б антигену по твердофазному иммуноферментному анализу. Спленоциты иммунных мышей в количестве 7,5 х 10 гибридизуют с
1,5 х 10 клетками миеломы Х 63 Ag
8-6.5.3. в присутствии 1 мп раствора, содержащего 457. полиэтиленгликоля с мол екуляр ной массой 4 000 и 1 OX диметилсульфоксида в течение 1 мин.
После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля высевают их в ячейки 96-луночной панели на олой перитонеальных макрофагов мыши.
Селекцию гибридных клеток проводят на среде, содержащей ГАТ-гипоксантин-аминоптерин-тимидин, Гибридыпродуценты клонируют два раза методом предельных разведений, высевая в ячейки 96-луночной панели с питающим слоем перитонеальных макрофагов.
После второго клонирования практически 1007 субклонов продуцируют антитела к тестируемому антигену. Продуктивный клон гибридных клеток (гиб, ридомы) обозначают БАМА-Бруцелла
Абортус Моноклональное Антитело.
Штамм гибридомы БАМА хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК/П/302 Д и характеризуется следующими свойствами.
Морфологическая характеристика.
I ультура состоит из слабоприкрепляющихся к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную клет— ку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка.
Культуральные свойства. Среда культивирования — среда RPHI-1640 с
10Х эмбриональной сывороткой теленка, 2 х 10 M глютамина, 1 х х 10 М пирувата натрия, 5 х 10 М
2-меркаптоэтанола, 1 х 10- N HEPES
50 мкг/мп гентамицина. Культивировао ние штамма ведут при 37,5 С в атмосфере с 57. СО . Характер роста — стационарная суспензия. частота пассивирования — через 2-3 сут, кратность рассева 1:3-1:4. Посевная концентрация клеток 1-2 х 10 в 1 мл.
Максимальная клеточная плотность
0,5 мпн/мч.
При внутрибрюшинной прививке сингенным мышам штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме íà 1012-й день. Доза клеток при привив5 ке 2 х 10 кл. За 7 дней до введения гибридомы необходимо инъецировать животным пристан — 2, 6, 10, 14 тетраметилпентадекан в дозе 0,5 мп
t на мышь. Штамм сохраняет способность продуцировать специфические монокло— нальные антитела в течение 5 пасса— жей на сингенных мышах (время наблюдения).
Продуктивность штамма. Гибридные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5 х 10 в 5 мл среды культивирования, инкубируют
3 — 4 дня при 37,5 С в атмосфере, со20 держащей 5/ СО . Культур ал ьную среду собирают, центрифугируют 10 мин при о
800 g и 4 С с целью отделения клеток от надосадочной жидкости — супернатанта, содержащего антитела. На 3-4 — и
25 день культивирования гибридомы концентрация монАТ достигает 35-45 мкг/мл t в культуральной среде.
При культивировании гибридомы in
vivo иммуноглобулиновую фракцию из асцитной жидкости получают высаливанием белков сульфатом аммония до 45Х насыщения с последующим диализом про— тив ЗФР (рН 7,2-7,3) при 4 С в тече— ние ночи. Полученные антителосодержащие материалы: супернатант и очищенную асцитную жидкость с конечной I концентрацией иммуноглобулинов 8 мг/мл используют как реагенты для излучения специфичности взаимодействия монАТ
40 с тестируемыми антигенами с помощью
PMA и ТИФА.
Характеристика полезного продукта, МонАТ относятся к классу IgG,, под классу 2а. Они специфичны к эпитопу
45 кор части полисахаридной цепи ЛПС бруцелл. Константа связывания 0,6 х х 10-8 N
Методы оценки специфичности МКА: реакция микроагглютинации — (РМА) и твердофазный иммунофермвнтный анализ (ТИФА), Контаминация штамма. Контаминантов
- линии, включая бактерии, грибы, дрожжи и микоплазму, не обнаружено.
Криоконсервация. К осадку гибрид55 ных клеток добавляют эмбриональную1 сыворотку теленка, а .затем диметил° сульфоксид до конечной концентрации
--.,107.. Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 1-5 млн кл в объеме 1 мл, помещают в коробку из nEíoïëàñòà и оставляют на а
1 сут при 70 С, после чего ампулы переносят в жидкий азот. Оттаивание замороженную ампулу быстро помещают о в водяную баню на 37 С, Как только растают последние кусочки льда, суспензию гибридомы переносят стерильной пипеткой в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной бессыворочной среды, отмывают один раз и засевают в ячейки 24-луночной гганели с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 737.
Пример 1. Исследование взаимодействия монАТ БАМА в реакции мик— роагглютинации (РМА) с различными видами и штаммами бактерий рода Brucella, a также с бактериями Yersinia
entегоcolitica 0:9, Escherichia coli, Campylobacter fetus veneralis.
РМА проводят в ячейках 96-луночной панели для микротитрования. В первую ячейку вносят 50 мкл неразведенного супернатанта, а с второй по восьмую ячейки — его двукратные разведения.
Очищенную асцитную жидкость раститровывают в 16 ячейках, начиная с 1:100. В качестве буфера для разведения используют ЗФР, РН 7,2-7,3.
Затем в каждую ячейку вносят по 5 мкл суспензии бактериальных клеток в кон— центрации 1 х 10 кл/мл. Результаты о реакции учитывают под световым микроскопом или визуально через 2 ч инкуба— ции при 37 С.
Полученные данные свидетельствуют о высокой специфичности монАТ БАМА к бактеРиЯм P«a Brucella и отсутствии пеРекРестной реактивности с бактериями Y. entегоcolitica, Е.coli, Campylobacter fetus veneralis.
Пример. 2, Исследование взаимодействия монАТ БАМА с очищенными полисахаридными антигенами (ЛПС и поли-Б) из различных видов и штаммов бактерий рода Brucella u Yersinia
entегоcolitica 0:9, в иммунофермен— тативном анализе, На полистирольную 96-луночиую панель для микротитрования сорбируют полисахаридные антигены (липополисахариды и поли-Б) Brucella u Yersinia entегоcolitica 0:9 в концентрации 1 мкг/мл в 100 мкл ЗФР (РН 7,27,3), инкубируя при 4 С в течение о
1604849 6 ночи. Панели отмывают три раза ЗФР и три раза ЗФР с 0,05Х Твином-20 (ЗФР-Тв), а затем в ячейки панели вносят двукратные разведения культуральной среды или очищенной асцитной жидкости в количестве 100 мкл и ино кубируют в течение 1,5 ч при 37 С.
Панель отмывают описанным способом и вносят в ячейки антитела кролика против иммуноглобулинов мьппи, ковалентно связанные с пероксидазой хрена. После окончания инкубации.(1ч, 37 С) повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных продуктов реакции, а связавшийся конъюгат определяют количественно по расщеплению субстрата Н О в присутствии хромогена-ортофенилендиамина. Поло20 жительная реакция характеризуется коричневым окрашиванием и учитывается
4 спектрофотометрически при длине волны 492 нм.
Результаты опыта по определению специфичности связывания иммуноглобулина из культуральной и очищенной асцитной жидкости в ТИФА показывают, что монАТ БАМА в наибольшем разведении (1:12800) реагируют с антигеном поли-Б из клеток Brucella melitensis
В-115, который лишен О-цепи ЛПС и состоит в большей части из "кор"участка полисахарида. Таким образом именно к последнему специфичны монАТ
БАМА.
Аналогичные эпитопы обнаружены антителами БАМА в ЛПС Brucella abortus.
Пример 3. Использование монАТ
-«i
БАМА в качестве 1-го лоя на твердой фазе в ИФА на выявление антигенов
Brucella в испытуемом материале.
На полистирольную 96-луночную панель для микротитрования сорбируют монАТ (20 мкг в 1 мп), очищенные вы45 саливанием сульфатoM аммония, в
100 мкл бикарбонатного буфера (pH
9,5) при 4ОС в течение ночи. Затем панель отмывают по три раза ЗФР и ЗФР-Тв, вносят в ячейки 100 мкл
50 пол ахаридного антигена в концентрации 1 мкг/мл в ЗФР— Тв и инкубируют
1,5 ч при 37 С. Панель отмывают опио санным способом, готовят в ячейках двукратные разведения поликлональной
55 сыворотки крупного рогатого скота в ЗФР-Тв (1:1000 и выше), имеющей равные титры антител против использованных видов бруцелл и иерсинии по
РМА и ТИФА. После выдерживания па1604849
Формула изобретения
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L.
ВСКК(П) N - 302Д, продуцирующий моноклональные антитела к бактериям рода
:Brucella.
Составитель Г. Игнатьева
Техред M.Коданич Корректор Л.Патай
Редактор Г. Гербер
Заказ 3434 Тираж 493 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина,101 нели при 37 С в течение 1 ч повтоо ряют процедуру отмывки и в ячейки вносят антитела против иммуноглобулинов быка, меченные пероксидазой.
Концентрацию связавшихся антител определяют по при меру 3.
Результаты изучения специфичности монАТ в "сэндвич" варианте ТИФА согласуются с данными предыдущих примеров.
Штамм гибридных клеток БАМА продуцируют моноклональные антитела, позволяющие дифференцировать бакте.рий рода Brucella от Yersinia entегоcolitica серовара 0:9, и может быть использован в разработке специ5 фических методов диагностики бруцеллеза.
