Способ определения активности антитромбина ш в плазме крови

 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам определения активности антитромбина Ш в плазме крови. Цель - ускорение способа. Измеряют скорости инактивации стандартного количества тромбина антитромбином Ш исследуемой плазмы, строят кривые скорости инактивации тромбина антитромбином Ш опытного и контрольного образцов плазмы, посредством сравнения которых получают искомое значение активности антитромбина Ш исследуемого образца. Исследование проводят в реакционной среде, содержащей 0,1 М натрий-фосфатного буфера и 0,15 М раствора NACL в объемном соотношении 1:1, PH 8,0-8,2. 2 ил.

(5f)5 G 01 N 33/68

ГОС ДАРС

ПО ЗО

Г1РИ ГК

Н BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) (22) (46) (71) цинс (72) (53) (56)

У 12 (54)

АНТ (57) не, ности антитромбина III исследуемой плазмы крови. Для этого исходные компоненты реакционной смеси — тромбин и исследуемую плазму разводят до стандартных концентраций О, 15 М раствора NaCl с рН 8,0-8,2. При ионной силе раствора ВаС1 =0, 1 и 0,2, активности антитромбина III 44 и 21Х соответственно.

При использовании данной реакционной среды создаются условия для увеличения на 25-30Х скорости реакции тромбин/антитромбин III исследуемой плазмы, что приводит к уменьшению времени определения активности антитромбина, III на 25-307. по сравнению с HsBecTHbM способом, и ка нови ния

Ц соба

Способ. осуществляют следующим об разом. скор роль орди абсц свер вре няя няя

Ц лени осущ опти ния

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

COLIHAЛИСТИЧЕСНИХ ,,;г -.— РЕСГ1УБЛИК

ТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

6РЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

НТ СССР

4418261/30-14

29.02,88

23. 11.90. Бкп. У 43

Минский государственный медиий институт

Л.А.Бизюк

612.015 (088.8) Авторское свидетельство СССР

9024, кл. G 01 N 39/68, 1986.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

РОМБИНА III В ПЛАЗМЕ КРОВИ

Изобретение относится к медициименно к способам определения обретение относится к медицине ается определения активности осro ингибитора системы свертыварови антитромбина III. ь изобретения - ускорение спофигф1-2 представлены кривые сти инактивации тромбина контого и опытного образцов по оси ат значения lg t, а на оси сс С„„ .соответственно время

ыванйя фибриногена в пробах и инкубации проб (на фиг.2 верхривая — по предлагаемому, нижпо известным способам). ь достигается тем, что опредеактивности антитромбина III ствляют в реакционной среде с льными параметрами для проявлеаксимальной ингибиторной актив

2 активности антитромбина III в плазме крови. Цель — ускорение способа. Измеряют скорости инактивации стандартного количества тромбина антитромбином III исследуемой плазмы, строят кривые скорости инактивации тромбина антитромбином III опытного и контрольного образцов плазмы, посредством сравнения которых получают искомое значение активности антитромбина III исследуемого образца. Исследование проводят в реакционной среде, содержащей О, 1 M натрий-фосфатного буфера и О, 15 М раствора NaC1 в объемном соотношении 1:1, рН 8,0-8,2. 2 ил.

1608585

Для осуществления способа используют следующие реагенты: реакционная среда: 1 об.ч. О, 1 M натрийфосфатного буфера с рН 8,0-8,2 (готовят смешиванием 95,0 мл 0,2 М раствора Na

Предварительно заготовленный ряст- 15 вор тромбина активностью 100 ед, NiH/ìë хранят в силиконированных флаконах при температуре -20 С, перед употреблением разводят в 5 раз реакционной средой до требуемой активно- 20 сти; фибриноген 8-10 г/л раствор в

О, 15 M NaC1 (достаточно до 5 мл) готовят перед исследованием; плазма крови (опытная и контрольная), Получают по обычной методике бестромбоци- 25 тарную плазму из веноэной крови, стабилизированной 38 г/л тринатрийцитратом в соотношении 9:1. Контрольная плазма, это пул плазм от 8-10 доноров. Сохраняется небольшими объ- 30 емами (до 1,0 мл) во флаконах при температуре -200С в течение-1 года без потери активности антитромбина

III 44

Перед употреблением контрольную и опытную плазмы разводят реакционной средой в 10 раз (к 0,45 мл реакционной среды добавляют 0,05 мл плазмы), получая 10 -ные растворы контрольной и опытной плазм. Для каждой исследуе- 40 мой плазмы готовят по 4 стеклянные пробирки с 0 1 мл раствора фибриногена и помещают в водяную баню при температуре 37 С.

Приготовленные пробирки с реаген- 45 тами и раствор тромбина перед исследованием прогревают до этой температуры.

Манипуляции, проводимые с контрольным и опытным образцами плазмы, являются идентичными: в пробирку с

0,5 мп исследуемой плазмы добавляют

0,5 мл раствора тромбина. Смесь встряхивают для получения малообъемного сгустка фибрина, Фибриновый сгусток отжимают и сразу удаляют из реакционной смеси. На 4,6,8 и 10 мин инкубации (t ) берут по О, 1 мп смеси и добавляют в пробирки с (j, 1 мл раствора фибриногена. Секундомером регистрируют время свертывания (t<} фибриногена остаточным тромбином смеси.

Отбор проб смеси можно делать и при других значениях t ù, увеличить или уменьшить кратность забора. Однако забор проб не должен быть больше

10 мин. инкубации смеси, так как резко возрастает значение t< а затем нарушается линейность хода реакции после 14-15 мин инкубации.

Вычисление. Из полученных в секундах значений t+ на 4,6,8 и 10 мин инкубации смеси, извлекают десятичный логарифм и получают соответствующие значения lg t . Кривые скорости инактивации тромбина антитромбином III контрольного и опытного образцов плазмы строят на миллиметровой бумаге в координатах: значения lg t на оси ординат, t „„íà оси абсцисс.

Обычно построейные кривые не имеют общего значения 1g t при нулевом значении t„„„. При расчете необходимо совместить начальные точки кривых с соблюдением угла их наклона (фиг. 1), считают, что любая выбранная точка на кривой скорости ннактивации тромбина антитрамбинам III контрольного образца соответствует 100% активности антитромбина III (такая точка взята на 10 мин инкубации смеси).

К ней соотносят точки вновь полученных кривых для опытных образцов (при одинаковом значении t1,„„) и таким образом получают искомое значение активности антитромбина ХХХ опытных образцов.

Пределы нормальных колебаний активности антитромбина ХХХ, определенные для донорской группы (19 человек), составляют 84-116%, 100 + 2,0% (X+ m). Коэффициент вариации для данного метода не превышает 1%.

Пример 1. У пациента 1, исследуя активность антитромбина ХХХ плазмы крови предлагаемым способом в динамике (й„„„=4,6,8 и 10 мин), получили значейия te=45,5; 71) 112 и 182 с и соответственные значения

1ц =1„658, 1,851; 2,049 и 2,260.

Для построения калибровочной кривой исследовали контрольную плазму при тех же значениях tz, получили, что и =41,5; 63," 96,5, 148 с и соответстве. ::;иые значения lgt<=1,618;

1,799; 1,9.-,:, 2,170. д ( н п н р к а э н н б

1608585 6 смоделированной кривой (П ), найдено значение активности антитромбина III для пациента 2, равное 797., что нике нормы.

Способ определения активности антитромбина III в плазме крови путем смешивания исследуемой и контрольной плазм с раствором тромбина с после20 дующей регистрацией скорости инактивации тромбина в пробах в динамике и их сравнения, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью ускорения способа, регистрацию проводят в среде инкубации, содержащей О, 1 М натрийфосфатный буфер с рН 8,0-8,2 и g 15 М раствор хлористого натрия в объемном соотношении 1:1.

По полученным значениям lgt роя т (фиг . 1) кривые для ко нтрол ьго образца плазмы (к) и для иссле емого образца плазмы пациента 1

<). При соотношении точек на 10 мин кубации для кривых опытного (П ) контрольного (к) образцов плазмы йдено, что значение активности антиомбина ХЕХ у пациента 1 равно 10

0X, — это в пределах нормы.

Пример 2. При исследовании обы плазмы крови у пациента 2 в димике (t„„„=4; 6, 8 и 10 мин) получизначения t<=29,5; 39,8, 56,5; 79 15 соответственно им значения lent = ,460, 1,600, 1, 752 и 1,898. ПостеннаЯ по полУченным значениЯм 18йс ивая скорости инактивации тромбина титромбином III образца плазмы паента 2 (П ) не имеет общего: значея lgt< с калибровочной при нулевом . ачении СMNL. Для получения возможсти их сравнения моделируют новую ивую (на фиг.1 обозначена крупным рихом).для пациента 2. Путем соотшения точек, взятых на 10 мин инкуции на калибровочной (к) и вновь

На фиг.2 верхняя кривая относится к предлагаемому, нюкняя - к известному способам. 100Х активность (точка

В) по известному способу достигнута только через 4,5 мин, по отношению к предлагаемому способу (точка А).

Формула изобретения

1á08585

100/е 4 -Х/Ф) 146 150 о

Составитель А.Агуреев

Редактор С.Патрушева Техред М.Дидык

Корректор А.Осауленко

Заказ Зб14 Тираж 507 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издател сил комбинат Патент"1 г. Ужгороду ул. Гагарина, 101