Способ получения ферментного препарата для количественного определения тиаминдифосфата в биологических объектах

 

Изобретение относится к способам получения ферментных препаратов из микробиологического сырья и может быть использовано в ферментной промышленности , а получаемый комплекс - для количественного определения уровня тиаминдифосфата (ТДФ). Цель изобретения - расширение технологических возможностей способа, ускорение процесса и удешевление целевого продукта, Способ предусматривает использование свежей пастообразной массы пивных дрожжей 7-9 регенераций. Готовят суспензию для экстрагирования белкового препарата, которую обрабатывают ультразвуком с частотой 20-22 кГц в течение 18-25 мин с последующим двухэтапным фракционированием ацетоном и сульфатом аммония. На первом этапе ацетонового фракционирования на каждые 1UU мл дрожжевого экстракта добавляют 55 мл ацетона, а на втором - 10 мл. Заключительную очистку выполняют адсорбционной хроматографией на аксиапатите элюцией комплекса 0,12 М фосфатным буфером до соотношения пируватдекарбоксилазной и алкогольдегидрогеназной активностей в ферментном комплексе 1 : (0,15-0,5) при пируватдекарбоксилазной активности не менее 14 ед. акт./мг белка. После заключительной очистки белкового препарата получают апопируватдекарбоксилазу в составе комплекса с последующей его стабилизацией. 3 ил. 3 табл. а SS О5 ГС О Ј 00 со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ((9! ((!! (5!)5 С 12 И 9/02

l.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4433062/13 (22) 30.05.88 (46) 15.01.91. Бюл. V - 2 (71) Институт биохимии АН БССР (72) И.П.Черникевич, Э.А.Гриценко и А.Ф.Макарчиков (53) 577.15.07 (088.8) (56) Ullrih.I. 3east Pyruvate Decarboxylase (2 — Oxoacid Carboxy — Lyase

ЕС 4.1.1.1). Ассау оГ Thiamine pyrophosphate, Methods in Enzymology. 1970, v 18 А, х. 109-115.

Авторское свидетельство СССР

У 1541255, кл. С 12 N 9/88, 1988. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО

ПРЕПАРАТА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИАМИНДИФОСФАТА В БИОЛОГИЧЕСКИХ

ОБЪЕКТАХ (57) Изобретение относится к способам получения ферментных препаратов из микробиологического сырья и может быть использовано в ферментной промышленности, а получаемый комплекс для количественного определения уровня тиамиидифосфата (ТДФ). Цель изобретения — расширение технологических

Изобретение относится к биотехнологии получения ферментных препаратов из микробиологического сырья и может быть использовано в ферментной промьппленности, а получаемый комплекс — для количественного определения уровня тиаминдифосфата (ТДФ) в

2 возможностей способа, ускорение процесса и удешевление целевого продукта

Способ предусматривает использование свежей пастообразной массы пивных дрожжей 7-9 регенераций. Готовят суспензию для экстрагирования белкового препарата, которую обрабатывают ультразвуком с частотой 20-22 кГц в течение 18-25 мин с последующим двухэтапным фракционированпем ацетоном и сульфатом аммония. На первом этапе ацетонового фракционирования на каждые 100 мл дрожжевого экстракта добавляют 55 мл ацетона, а на втором—

10 мл. Заключительную очистку выполняют адсорбционной хроматографией на аксиапатите элюцией комплекса 0,12 M фосфатным буфером до соотношения пируватдекарбоксилазной и алкогольдегидрогеназной активностей в ферментном комплексе 1 : (0,15 — 0,5) при пируватдекарбоксилазной активности не менее 14 ед. акт./мг белка. После заключительной очистки белкового препарата получают апопируватдекарбоксилазу в составе комплекса с последующей его стабилизацией. 3 ил. 3 табл.. крови или другой биологической жидкости с целью диагностики ранней

В -недостаточности при обслецовании ( различных слоев населения в стационарных условиях клиники или в обычных условиях, а также в животноводстве при выращивании молодняка на жи1620483

50 вотноводческих комплексах и в зверохозяйствах.

Определение общего ТДФ в биологических объектах осуществляют ферментативном методом, который основан на способности дифосфорного эфира как кофермента рекомбинировать в апопируватдекарбоксилазой. Образующаяся при этом активная холоформа белка ок .сляет пируват до уксусного альдегида, который в сопряженной системе с алкогольдегидрогеназой и восстановленным никотинамидадениндинуклеотидом (НАДН) превращается в этиловый 15 спирт. О скорости реакции судят по снижению поглощения НАДН при 340 нм.

Количественное содержание ТДФ,.пропорциональное акт вности образовавшейся холопируватдекарбоксилазы и 20 убыли восстановленного НАД, находят по калибровочному -рафику с известными концентрациями кофермента. Основ ными компонентами системы, обеспечивающими рекомбинацию тиаминдифосфата 25 и последующее окисление пирувата, а затем и НАДН, служат алкогольдегидрогеназа и апопируватдекарбоксилаза.

Цель изобретения — расширение технологических возможностей способа, ускорение процесса и удешевление целевого продукта.

Опособ осуществляется следующим образом.

Берут свежую пастообразную массу

«5 пивных црожжей Saccharomyces carlsbergensis 7-9 регенераций и готовят суспензию для экстрагирования белкового препарата. Приготовленную суспензию обрабатывают ультразвуком с частотой 20-22 кГц в течение 18-25 мин и проводят двухэтапное фракционироаание ацетоном и сульфатом аммония.

На первом этапе ацетонового фракционировапия на каждые 100 мп дрожжевого

45 экстракта добавляют 55 мп ацетона, а на втором — 10 мл ацетона. Затем выполняют адсорбционную хроматографию на гидроксиапатите элюцпей комплекса О, 12 М фосфатным буфером до соотношения пируватдекарбоксилазной и алкогольдегидрогеназной активностей в полученном ферментном комплексе

i:(0, 15-0,5), причем пируватдекарбоксилазная активность должна составлять не менее 14 зд.акт./мг белка.

После заключительной очистки на гидроксиапатите белкового препарата получают апопирузатдекарбоксилазу в составе комплекса с последующей его стабилизацией, так как ферментативный метод определения ТДФ в биологических объектах с использованием ферментного комплекса основан на способности дифосфорного эфира как ко фермента рекомбинировать с апопируB,".."..äeêàp áoKcHës soé.

Наилучший эффект от использования способа наблюдается при проведении ацетонового фракциониронания на первом этапе добавлением 55 мл ацетона на каждые 100 мл дрожжевого экстракта и заключительной очистки целевого продукта элюцией комплекса 0,12 М фосфатным буфером до соотношения пируватдекарбоксилазной и алкогольдегидрогеназной активностей B ферментном комплексе 1:(0,15-0,5), при пируватдекарбоксилазной активности не менее

14,0 ед.акт./мг белка.

Увеличение количест ю вносимого ацетона свыше 55 мл на каждые 100 мл дрожжевого экстракта на первом этапе ацетонового фракционирования ведет к удалению из ферментного комплекса одного из двух компонентов — алкогольдегидрогеназы. При повышении первоначального объема ацетона от 58 до

60 мл, добавляемого на каждые 100 мл дрожжевого экстракта, ферментный комплекс содержит остаточные концентрации (следы) алкогольдегидрогеназы, а увеличении количества ацетона свыше

60 мл — алкогольдегидрогеназа в комплексе не обнаруживается. Уменьшение объема ацетона ниже 55 мл, добавляемого на каждые 100 мл дрожжевого экстракта, резко снизит содержание пируватдекарбоксилазы в ферментном комплексе. При добавлении 52-53 мл ацетона на каждые 100 мл дрожжевого экстракта ферментный комплекс содержит следы пируватдекарбоксилазы, при внесении 54 мл ацетона — активность пируватдекарбоксилазы снижена.

Увеличение молярности фосфатного буфера свыше 0,12 М ведет к снижению активности ферментного комплекса за счет элюции примесных белков, а снижение молярности этого же буфера ниже 0,12 M способствует разделению алкогольдегидрогеназы и пируватдекарбоксилазы (алкогольдегидрогеназа остается на колонке с адсорбентом), Для количественного определения тиаминдифосфата в биологических объектах ферментативным методом необходимо, 50

5 16204 чтобы соотношение пируватдекарбоксилазной и алкогольдегидрогеназной активностей в ферментном комплексе составляло 1;(0,15-0,5) при пируватдекарбоксилазнои активности не менее

14,0 ед.акт./мг белка.

Превышение указанных верхних пределов не приводит к существенному повышению чувствительности ферментативного способа определения ТДФ с использованием ферментного комплекса в биологических объектах по сравнению с применяемым соотношением пируватдекарбоксилазной и алкогольдегидро15 геназной активностей, а снижение указанных пределов способствует резкому ослаблению чувствительности. Кроме того, уменьшение пируватдекарбоксилазной активности ниже 14,0 ед.акт./мг 20 белка также ведет к значительному ослаблению чувствительности ферментативного способа определения ТДФ с использованием данного комплекса в биологических объектах. 25

Изобретение иллюстрируется примерами.

Пример 1. Подготовка исходного материала, выделение и очистка комплекса пируватдекарбоксилазы и ал- 30 когольдегидрогеназы. Берут 5 кг свежих пивных дрожжей Saccharomyces

carlsbergensis 7-9 регенерации. Свежие дрожжевые клетки многократно промывают холодной водой и центрифугируют 35

15 минут при 5000 g. Полученную пастообразную массу используют для приготовления суспензии и экстрагирования белкового препарата. Для этого 400 r дрожжевых клеток смешивают с 1750 мл 4р водного раствора, содержащего 67 мл глицерина, 0,668 r ЭДТА, 13,2 r Na HPO4, и 2,8 г (МН4) $0 . Приготовленную суспензию интенсивно перемешивают в течение 10 мин. Смесь охлаждают до 45

-2 С и обрабатывают ультразвуком при частоте 22 кГц в течение 20 мин, добиваясь полного разрушения клеток, способствующего максимальному выходу конечного продукта. Полученный дрожжевой экстракт центрифугируют в течение 30 мин при 4000 g, а затем 1 ч при 105000 g. Осевшие после центрифугирования субклеточные фракции удаляют, а на каждые 100 мл надосадоч/ ной жидкости при непрерывном перемешивании приливают по 55 мл ацетона, охлажденного до -20 С, не допуская нагревания раствора выше О С. После

83 6

15-минутного выдерживания при этой температуре суспензию центрифугируют в течение 5 мин при 4000 g и осадок отбрасывают. На каждые 100 мл надосадочной жидкости повторно приливают по 10 мл ацетона, снижая температуру раствора до -2 С. Через 15 мин экстракт центрифугируют, а конечный осадок быстро суспендируют в 400 мл

0,02 M трис-НС1 буфера, рН 7,3, с

1 М ЭДТА и 5 мМ цистеин-гндрохлоридом. После 30-минутного перемешивао ния при О С однородный белковый раствор подвергают фракционированию сульфатом аммония, добавляя 108 r сухого измельченного (ИН ) $0 . Через 1 ч смесь центрифугируют, осадок отбрасывают, а на каждые 100 мл надосадочной жидкости повторно вносят по 7 г сульфата аммония в течение 20 мин при перемешивании. Высоленный белок собирают центрифугированием.

Заключительную очистку осуществляют методом адсорбционной хроматографии на гидроксиапатите. Экспериментально подобрано значение рН и ионной силы уравновешивающего буфера, при котором ферментный комплекс не связывается адсорбентом и обнаруживается в первых же фракциях элюирующего раствора, тогда как сопутствующие примеси все еще эффективно удерживаются на носителе. С этой целью белок (3 г) сульфо-аммонийной пасты диализуют в течение 4 ч против

20-кратного объема 0,12 М натрий †(>ocфатного буфера, рН 6,8, с 2 мМ Мр +, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ТДФ и 5 мМ цистеингидрохлоридом, а выпавший осадок удаляют центрифугированием. Надосадочную жидкость разбавляют исходным

0,12 М натрий-фосфатным буфером до концентрации белка в растворе 10 мг/мл, смешивают с 3-кратным объемом уплотненного осадка гидроксиапатита, уравновешенного этим же буфером, и после

10 мин экспозиции при 4 С центрифугируют 10 мин при 12000 g. Надосадочная жидкость содержит смесь алкогольдегидрогеназы и пируватдекарбоксилазы. Для полноты экстракции адсорбент повторно промывают, белок надосадочной жидкости объединяют, осаждают (NH ) S0q (полное высаливание) и собирают центрифугированием. На данном этапе очистки (табл. 1) удельная активность пируватдекарбоксилазы возрастает в 2,9 раза (с 4,8 ед, акт., мг

1620483 до 14,0 ед. акт. /мг), а алкогольдегидрогеназы — в 1„75 раза (с 1,2 ед.акт./мг до 2,I ед.акт./мг) и является приемлемой для ферментативного определе5 ния содержания ТДФ. Соотношение пируватдекарбоксилазной (14 ед.акт./мг белка) и алкогольдегидрогеназной (2,1 ед.акт./мг белка) активностей в ферментном комплексе составляет

1:0,15 (табл. 1).

Процесс выделения занимает 12 ч.

Пример 2. Получение апопируватдекарбоксилазы в составе комплекса и его стабилизация.

Получение апопируватдекарбоксилазы основано на способности холофермента легко диссоциировать в щелочной среде с освобожде| .ем ТДФ и ионов

Mg . Для удаления кофермента осаж20 денный после фракционирования на гидроксиапатите фегментный комплекс (680 мг) растворяют в 5 мл 0,01 М трис-НС1 буфера, рН 9,0, с 1 мМ ЭДТА и 5 мМ цистеин-гидрохлоридом, выдер- 25 живают для полноты диссоциации при данном рН в течение 15 мин и наносят на колонку (5,4Х70 см) с декстрановым гелем ЗД-1,0 (фракция до 50 мкМ), .уравновешенную исходным буфером. По мере выхода белка раствор собирают в объеме 30 мл. ТДФ элюируется позже, начиная с 40 мп. В таком состоянии без кофермента апофермент чувствителен к наличию с льфгидрильных реаген35 тов, ионов металла, воздействию рН, температуры и ионной силы буферного раствора, поэтому скорость тока жидкости через колонку должна быть достаточно высокой (36-48 мн/ч), а элюируемый белок после выхода немедленно стабилизирован (способность к рекомбинации апопируватдекарбоксилазы дрожжей сохраняется в 0,01 М трис-НС1 буфере, рН 9,0 в течение

3-4 ч). Все операции по выделению апофермента и последующей защите от инактивации проводят при 4 С.

Стабилизацию комплекса апопируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогена" зы осуществляют глицерином или сульфатом аммония в присутствии ионов

Мр +. В первом случае значение рН элюируемого с колонки раствора апофермента снижают 0,05 М натрий-фосфатным буфером до 6,8, а затем сюда

55 же вносят глицерин и 0,5 I MgSOy до конечной концентрации компонентов

347 и 0,02 М соответственно. Во втором — к белковому элюату при непрерывном перемешивании приливают равный объем 5,4 II сульфата аммония в

0,1 М натрий-фосфатном буфере, рН 6,8, с 0,04 М MgSOg, после чего белок лиофилизируют на установке для сублимационной сушки при температуре

-3 С и давлении 6 .10 Па. В 307-ном Ф глицерине в присутствии Mg реактивация апопируватдекарбоксилазы с низкими концентрациями ТДФ и алкогольдегидрогеназная активность остаются высокими в пределах 1,0-1,5 недель, позволяя проводить серийные исследования уровня ТДФ в биологических объектах без ежедневной практики подбора необходимой концентрации белкаапофермента, как это наблюдается в случае работы с сульфо-аммонийными препаратами. .Ниофилизированный из 2,7 М (NH )

С целью диагностики В -недостаточности с использованием ферментного комплекса животных за 12 ч до забоя лишают пищи. После декапитации животного исследуемые ткани быстро извлекают, очищают от оболочек: продавливают через пресс с диаметром пор 1 мм и гомогенизируют в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком (7-9 движений) с

5 объемами охпажденной до 0 — 2 С 7%-ной трихлоруксусной кислоты. Гомогенат центрифугируют 10 мин при

3000 об/мин, а осадок повторно перемешивают с 5 объемами 7Х-ной трихлоруксусной кислоты при 0 — 2 С с поо

-следующим центрифугированием. Полученную от двух центрифугирований надосадочную жидкость дважды обрабатывают 3 объемами насыщенного водного раствора эфира длч удаления трихлоруксусной кислоты. Конечное разведение для тканей печени, почек, сердца, равное 1:20, а мозга и мышц 1:10 достигается внесением к безбелковому экстракту 0,05 M натрий-фосфатного буфера рН 6,8, после чего отбирают аликвоты по 0,1 мл для рекомбинации содержащегося в тканях ТДФ с апопируватдекарбоксилазой фурментного комплекса. Рекомбийацию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин, 1620483

35

Для этого к анализируемым аликвотам добавляют по 0,1 мл 0,02 M МАМБО и

О,1 мл раствора очищенного ферментного комплекса апопируватцекарбокси5 лазы с алкогольдегицрогеназой (200600 мкг белка), разбавленного до необходимой концентрации 0,05 M натрийфосфатным буфером, рН 6,8, Общий объем доводят исходным 0,05 М натрий- 10 фосфатным буфером до 0,8 мл. По истечении времени инкубации в каждую пробу вносят по 2,0 мл 0,15 М натрийцитратного буфера, рН 5,9 и 0,1 мл

0,2 М пировинограднокислого натрия.

Реакцию запускают добавлением 0,1мл

0,5 мМ НАД Н, измеряя изменение оптической плотности раствора первые 3 мин при .4 340 нм. По суммарной величине спектрофотометрически регистрируемой оптической плотности (0D) находят соответствующее ей значение точки на калибровочной кривой.

Ее параметры, умноженные на исходное разведение ткани, соответствуют искомому значению концентрации общего ТДФ.

Кровь отбирают из безымянного пальца обследуемых пациентов, в течение 8-10 ч до анализа не принимавших пищу. Для определения уровня

ТДФ 0,2 мл капиллярной крови смешивают с 0,4 мл охлажденного до 4 С

0,05 M натрий-фосфатного буфера, рН 6,8, содержащего 2Z-ный гепарин.

После 15-минутной экспозиции при

4ОС смесь кипятят 2 мин, центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин и отсюда отбирают аликвоты по 0,2 мл для рекомбинации ТДФ исследуемых проб с апопируватдекарбоксилазой. Условия проведения рекомбинации идентичны таковым для животных тканей.

Искомые значения точек для калибровочного графика находят в аналогич45 ных для рекомбинации исследуемых oGразцов крови или тканей условиях, используя вместо 0,1 мл тканевого экстракта или 0,2 мл крови известные концентрации (О 005-0 2 мкг) хромаУ У

50 тографически чистого препарата ТДФ.

По получаемым при этом разностям экстинкции восстановленного и окисленного НАД, регистрируемым первые 3 мин протекания сопряженной ферментативной реакции реактивированной холопируватдекарбоксилазы и алкогольдегидрогеназы дрожжей при 340 нм, строят калибровочную кривую, откладывая по оси абсцисс используемые концентрации

ТДФ, а по оси ординат соответствующие им значения экстинкции за вычетом контроля, фиксирующего степень самопроизвольного окислени НАД Н< в отсутствие ТДФ (см. фиг. 1-3), Г:ри ферментативной детекции общего ТДФ в анализируемых пробах крови или тканей регистрируемые в эксперименте величины экстраполируют на калибровочную кривую, а затем на ось абсцисс с известными концентрациями ТДФ.

Пример 4. Интервал концентраций ТДФ, в котором сохраняется линейность сопряженного процесса с использованием комплекса.

HN - фиг. 1-3 представлены зависимости суммарной скорости сопряженного ферментативного процесса от концентрации ТДФ при различных полярных концентрациях предлагаемого комплекса в отсутствие (фиг. 1-2 а) и при добавочном внесении (фиг. 1 и 2 б) коммерческой алкогольдегидрогеназы. Как видно из графиков, в исследуемом интервале концентраций кофермента, при содержании белка 0,18-0,60 мг, удовлетворительная линейность суммарной скорости процесса сохраняется до

0,3 мкг ТДФ. При более низком чем

0,18 мг содержании комплекса в силу недостаточной разности экстинкции между контрольной и опытной пробами в случае малых концентраций ТДФ снижается точность ферментативного определения (см. таблицу 3). Концентрация комплекса 0,6 мг практически обеспечивает белковое насыщение и ее увеличение способствует непроизводительным затратам комплекса. Дополнительное внесение коммерческой алкогольдегидрогеназы (50 мкг на пробу) к комплексу не ведет к увеличению скорости (см. фиг. 1-2) сопряженного процесса, свидетельствуя тем самым о достаточности ферментативной активности алкогольдегидрогеназы дрожжей в составе комплекса.

Пример 5. Чувствительность и точность определения.

Согласно данным табл. 3 ферментативный метод количественного определения общего ТДФ с использованием комплекса позволяет фиксировать конI центрации кофермента в дозе 0,005 мкг, а точность измерения составляет в среднем 1,96Х.

1620483

Формула изобретения

Способ получения ферментного препарата для количественного определения тиаминдифосфата. в биологических объектах, предусматривающий выделение пируватдекарбоксилазы из экстракта пивных дрожжей путем фракционирования ацетоном, фракционирования сульфатом аммония в интервале концентраций 44-53Х насыщения и хроматографической очистки, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью расширения технологических возможностей способа, ускорения процесса и удешевления конечного продукта, совместно

Таблица

Общая активность, ед.акт.

Белок, мг

Стадия очистки

ПДК АДГ ПДК АДГ ПДК АДГ

6840

57000 22060

0,12

0,39

5,4 3,9

8400 . 17640 3950

0,47

2760

12 3 10,0

4,8

2300 13440

1,2

36,0 17,5

1428

2,1

14,0

680 9520

Таблица 2 яа м

Время хранения

1сходиея ревхтивацня аноС та били виру>хна я сиесь

Мсходиая ЛДГ

Часы ность 3 6 12 24 168 33

3 6 9 12

В отсутствие ствбнливвторов - 0,0! М трио-НС1 буфер, рН 9,0

76

2,05

3,6 0

2,0 1,9 .1,63 .1,9!

2,05

19

2,0

16 10,5

2,0 1,S

2,05 г 0

15 0,9

53

1,8

32

96 " 84

2,0 2,05!

2,05!

00 г,!!

00 97 86 87

2,1 2 05 2 05 2,0

2,0!

0О 2,05

> !

0О

2,1

79 55

2 05 2>0

23 !2

2,05 . 1 ° 9

87

2,0 !

61

2,05

84

2,05

51 0 !,7 1,2

32 21

2,0 . 2,0

100 98 92 74 66

20 21 205 19 15

2,1

Исходный экстракт

Фракционирование ацетоном

Фракционирова" ние сульфатом аммония

Хроматография на гидроксиапатите

2 После снияения рН

0,05 М натрий-фосфатньи буфером до 6,8

302-ный раствор глицерина в 0,052 М натрий-фосфатнои бу фере, рН 6,8

4 307-ный раствор глицерина. с 0,02 НМ8$04, рН 6,8

5 302-ньй раствор глице" рина с 1 мМ ЭДТЛ и

5 иМ цнстеингидрохлоридои, рй 6,8

6 0,02 и MBS04 в 0,05 натрий-фосфатиои буфере, рН 6,8

7 После лиофилизац>и> ив

2 7 М раствора (НН>3аЯО+> р1 6,8 с пируватдекарбоксилазой выделяют алкогольдегидрогеназу, при этом фракционнрование экстракта ацетоном проводят в интервале концентраций 35,55

41,1% и. хроматографическую очистку проводят методом адсорбционной хроматографии на гидроксиапатнте в 0,12 M фосфатном буфере до соотношения пиру10 ватдекарбоксилазной и алкогольдегид» рогеназной активностей в ферментном препарате 1:(0,15-0,5) и до величины пируватдекарбокеилазной активности не менее 14 0 ед/мг белка, а пируватдекарбоксилазу в составе препарата

15 получают в виде апофермента.

Удельная активность, Степень ед.акт./мг белка очистки

1620483

Продолжение табл. 2

Время хранения

Исходная реахтинаиня алопдк

Стабиличируяхаая смесь

Own

Исходная АПГ Часы

12 24

3 (6 IO0 !00 100 977 о4

2,05 2,1 2,05 2,05 2,0

2,05

8 После лиофиличлиии их

2,7 И растяора (%4)т80ч с 0,02 И ИВВОч, рП 6,8

9 После лиофиличяиин ич

2,7 и раствора (н!1,)т504 с I мИ ЭЛТЛ и 5 и!! цистеии-тидоохлоридом, рП 6,8

10 После лнофиличяпин из

0,05 И фосфятиого буфера, plI 6,8

93 84 73 47 40

2,0 2,05 2,05 2,0 1,9!

2,1

3 1,2

0,36 0,25

0,4

Таблица 3

Разность экстинкции восстановленного и окисленного НАД, регистрируемая пе вые 2 мин сопряженной ферментативной реакции при 340 нм, в ОД

ТочнОсть

Проба определения, 7

II III IU

I U

0 20 20 20

0 01 40 45. 40

0,02 80 90 80

0 04 170 180 180

0,06 290 280 280

0,10 440 430 440

1 кон.тр оль

3

S

Содержание ТДФ в инкубационной сре де, мкг

30 30

40 40

80 90

180 180

280 280

430 430

Среднее значение убыли НАД.Н, в

45ОД и ошибка среднего значения

24 + 2,449

41 1,000

84 2,449

178 + 2,000

282 0 2,000

434 + 2,449

4,16

2,44

2,78

1,10

0,70

0,56

I б20483

О,1 02

/ ТД, ntrz дема) g,Яра Дог. Г

Яд

Редактор М. Недолуженко

Заказ 4220 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101

ОУ

< О7

Составитель А.Н.Семенов

Техред JI.Îëèéíûê Корректор А.Осауленко