Способ определения флавонолов в растениях

 

Изобретение относится к биохнмии растений9 к способам определения биологически активных веществ, а именно к количественному определению флавонолов . Целью изобретения является сокращение продолжительности процесса . Растительное сырье перед экстрагированием этиловым спиртом подвергают воздействию комплекса ферментов, содержащего пекта-i тт азу, пектинлиазу, пеллюлазу и ксиланаз. Причем обработку проводят водным раствором комплекса ферментов с активностями; ед/мл: пектатлиаза 800-1200; пектинлиаза 50-90; целлюлаза 0,8-1,2 ксиланаза 0,8-1,4 при 29-31 °С в течение 2.0-3,0 ч с, 4 табло i

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

C 12 Î I/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И OTHPbfTHRM

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4648077/13 (22) 07.02.89 (46) 28.02.91. Бюл. ¹ 8 (71) Институт микробиологии АН БССР (72) А.Г.Лобанок, С.П.Римкене, Н.Я;Борисевич, Б.-Э.А.Маламене, Ж.И.Павловская и Г.В,Жук (53) 577.154 ° 35(088.8) (56) Актуальные вопросы ботанического ресурсоведения в Сибири. Сборник, изд-во "Наука" СО АН СССР, Новосибирск, 1976, с. 206-209. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЛАВОНОЛОВ

В РАСТЕНИЯХ (57) Изобретение относится к биохиИзобретение относится к биохимии растений, к способам определения биологически активных веществ, а именно к количественному определению флавонолов.

Цель изобретения — сокращение продолжительности процесса.

Сущность изобретения поясняется

° следующими примерами.

Пример 1. 3 r образца воздушно-сухого сырья 2-летних растений пустырника волосистого (Leonurus

villosus Desf) заливают 30 мл водного раствора комплекса ферментов с активностями, ед/мл:

Пектатлиаза 1000

Пектинлиаза 70

Целлюла з а 1

Ксиланаза 1,2 и выдерживают при 30 С в течение о

2,5 ч. Затем четь;рехкратно экстраги„„SU„,)6319Я А1

2 мии растений, к способам определения биологически активных веществ, а именно к количественн -му определению флавонолов. Целью изобретения является сскращение продолхлтельности процесса. Растительное сырье перед эксграгированием этиловым спиртом подвергают воздействию комплекса ферментов. содержащего пекта",,".:.азу, пектинлиазу, пеллюлазу и ксиланазу, Причем обработку проводят водным раствором комплекса ферментов с активностями, ед/мл: пектатлиаза 800-1200; пектин-:

1 лиаза 50-90; целлюлаза 0,8-1,2 ксиланаза 0,8-1,4 при 29-31 С в течение 2 .0-3,0 ч. 4 табл. руют с обратным холодильником при нагревании на кипящей водяной бане (по 20 мин с каждой свежей порцией этилового спирта, равной 30 мл). Полученные экстракты объединяют и испаряют досуха на водяной бане. В сухой остаток тотчас приливают 4 мл спирта, 1,0 мл этого экстракта наносят на хроматографическую бумагу "Ленинградская средняя". Хроматограмму с нанесенным экстрактом разгоняют в смеси уксусной, муравьиной кислоты и воды в соотношении 10:2:3 восходящим способом в течение 24 ч при комнатной температуре.

Высушенную хроматограмму проявляют путем опрыскивания 10Х-ным спиртовым раствором хлористого алюминия. Пятна флавонолов, окрашенные в желтый и желто-зеленЫй цвет, отмечают при просвечивании в УФ-свете, вырезают, измельчают и исчерпывающе элюируют

1631088

20

30

95-96Х-ным спиртом (сначала 5 мл, затем 2-3 раза по 2 мл) при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 15 мин.

Элюат доводят тем же спиртом до объема 10 мл и измеряют оптическую плотность раствора с помощью фотоэлектроколориметра при синем светофильтре в кюветах с толщиной слоя 2 см. Параллельно в тех же условиях хроматографируют стандартный раствор рутина для построения калибровочного графика. Содержание флавонолов в образце определяют по формуле где А — содержание флавонолов в образце растения, мг/100 г; а — содержание флавонолов (мг) в

1 мл элюата, найденное по калибровочному графику; P — объем экстракта образца, мл;

V — объем нанесенного на хрома( тограмму экстракта образца, мл;

V — объем элюата, мл;

К вЂ” коэффициент пересчета содержания флавонолов на 100 r сырья;

Содержание флавонолов в образце сырья пустырника волосистого, определенное согласно описанному методу, составляет 74,5 мг/100 г.

Пример ы 2-5 ° Осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что используют водный раствор комплекса ферментов с различными активностями (см.табл. I).

Содержание флавонолов (мг/100 г сырья). определенное согласно примерам 2-5, приведено в табл. 2.

Таким образом, наиболее полное экстрагирование флавонолов из растительного сырья наблюдается при использовании комплекса ферментов (примеры 1, 3, 4) с активностями, ед/мл:

Пектатлиаза 800-1200

Пектинлиаза 50-90

Целлюла за- 0,8-1,2

Ксиланаза 0,8-1,4

Пример ы. 6-9. Осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что обработку растительного сырья водным раствором комплекса ферментов проводят при различных температурах (см.табл. 3).

Таким образом, наиболее полное экстрагирование флавонолов из растительного сырья наблюдается при 29-31 С (примеры 1, 7, 8) . Увеличение температуры до 33 С (пример 9) не увеличивает количество флавонолов, экстрагируемых из растительного сырья, Пример ы 10-13. Осуществляют аналогично примеру 1, за исключением того, что обработку растительного сырья водным раствором комплекса ферментов проводят в течение различного времени (см.табл. 4).

Таким образом, наиболее полное экстрагирование флавонолов наблюдается при обработке сырья в течение

2-3 ч.

Формула и з о б р е т ения

Способ определения флавонолов в растениях, предусматривающий воздействие на растительное сырье для обеспечения полноты извлечения, исчерпывающее экстрагирование этиловым спиртом и колориметрирование элюатов, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью сокращения продолжительности процесса, растительное сырье перед экстрагированием этиловым спиртом подвергают воздействию комплекса ферментов, содержащего пектатлиазу, пектинлиазу, целлюлазу и ксиланазу, причем обработку проводят водным раствором комплекса ферментов с активностями, ед/мл:

Пектатлиаза 800-1200

Пектинлиаза . 50-90

Целлюлаза 0,8-1,2

Ксиланаза О, 8-1,4 при 29-31 С в течение.2,0-3,0 ч.

1631088

Таблица 1

Подбор состава ферментного комплекса для выделения флавонолов

Ферменты

Активности ферментов, ед/мл, по примеру

2 (конт- 3 роль) 1 (оптимум) 5 (контроль) Таблица 2,Зависимость выхода флавонолов ог состава фермент ого комплекса

Содержание флавонолов, мг/100 г, по примеру

2 (контроль) 3 1 -(оптимум) .4

74 2

74,4

74,5

65,0

Таблица 3

Зависимость выхода флавонолов от температуры

Содержание флавонолов, мг/100 r съгрья, по примеру

6 (контроль) 25 С

1 (оптимум) 30 С

9 (контроль)

33 С

29 С

31 С

74,3

74,5

62,2

74„0

74,4

Таблица 4

Зависимость выхода флавонолов от длительности обработки сырья

Содержание флавонолов, мг/100 r сырья, по примеру

10 (контроль)

1,5 ч

13 (контроль) 3,5 ч

1 (оптимум}

2,5 ч

3,0 ч

11

2,0 ч

60,5

174,3

74,4

74, 5.

73,9

Составитель Н. Родова, Техред Л.Серд|окова Корректор Т, Палий

Редактор M. Келемеш

Заказ 524 Тираж 363 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская .наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

Пектатлиаза

Пектинлиаза

Целлюлаза Ксиланаза

0,5

0,6

800 1000

50 70

0,8 1,0

0,8 1,2

1,2

1,4