Способ определения активности рибофлавинкиназы
Изобретение относится к биохимии , в частности к способам определения активности соерментов, а именно рибофлавинкиназы (АТФ:рибофлавин- 5 -фосфотрачс(Ьера-эы9 К.Ф. 2.7.1.26). Целью изобретения является упрощение и удешевление способа. Способ заключается в том, что инкубацию исследуемой пробы, содержащей рибофлавинкиназу, проводят в присутствии рибофлавина, адекоз к-Н -трифосфата и ионов , а колии ство .образовавшегося ФМК определяет флуориметрией пробы после удаления из нее непрореагировавшего субстрата-рибофлавина при помощи транспорта этого вещества в клетки дрожжей Pichia guiller- mondii ВКПМ 4-432, содержащих высокоактивную и специфичную к рибофлавину транспортную систему - рибофлавинперлиазу. 1 ил., 1 табл. i
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТ1+1ЕСНИХ
РЕСПУЬЛИН (1) С 12 (1 1 00
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ
ПО ИЗОИРЕтаНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГННт ССОР (21) 4666534/ 11 3 (22) 23.03.89 (46) 28.02.91. Бюл. Н- 8 (71) Львовское отделение Института биохимии им. А.В. Палладина (72) В,Е. Кащенко, Е,Н.Преображенская и А.А.Сибирный (53) 577.15,08.(088.8) (56) Кащенко В.Е. и Шавловский Г.М.
Очистка и свойства рибофлавинкиназы дрожжей Pichia guilliermondii, Биохимия, 1976, т. 41, Р 2, с. 376383.
Naybew S.G., Wassink J.Í. А continuous fluorometric assay for flavokinase. Properties of flavokinase
from Peptostrentococcus elsdenzx.
Biochimica et Biophysica, Acta, 1977, .v. 482, р. 341-347. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ
РИБОФЛАВИНКИНАЗЪ|
Изобретение относится к биохимии и может быть использовано в научноисследовательских лабораториях и в микробиологической промышленности для определения активности фермента »
;l рибофлавинкиназы (АТФ:рибофлавин-5— фосфотрансферазы, К.Ф. 2.7.1.26).
Рибофлавинкиназа катализирует реакцию фосфорилирования рибофлавина с образованием рибофлавин-5 †.фосфата-флавинмононуклеотида (ФМН) т.е. осуществляют первую реакцию превращения витамина В в коферментные формы — ФМН и флавинадениндинукпео тид (ФАД), которые входят в качестве простетических групп в состав целого
2 (57) Изобретение относится к биохимии, в ча с тно с ти к спос об ам опр еделения активности ферментов, а именно рибофлавинкиназы (АТФ:рибофлавин5 -фосфотрачсферазы, К,Ф. 2.7.1.26).
Целью изобретения является упрощение и удешевление способа. Способ заключается в том, что инкубацию исследуемой пробы, содержащей рибофлавинкиназу, проводят в присутствии рибо" флавина, аденозин-5 -трифосфата и
-! ионов Mg +, а количсство.образовавшегося ФМН определяют флуориметрией пробы после удаления из нее чепрореагировавшего субстрата-рибофлавина при помощи транспорта этого вещества в клетки дрожжей Р1сЬ1а guillermondii ВКПМ 4-432, содержащих высокоактивную и специфичную к рибофлавину транспортную систему — рибофлавинперлиазу. 1 ил., I табл. ряда окислительно-восстановительных ферментов — флавопротеинов.
Цель изобретения — упрощение и удешевление способа.
Способ заключается в том, что инкубацию исследуемой пробы. содержащей рибофлавинкиназу, проводят в присут/ ствии рибофлавина, аденозин-5 —.трифосфата (АТФ) и ионов Ng а количество
2+ образовавшегося ФМН определяют флуорометрией пробы после удаления из нее ненрореагировавшего субстрата — рибофлавина при помощи транспорта этого вещества в клетки штамма дрожжей
Pichia guilliermondii .BKiIM У-432, содержащих высокоактивную и специфич1631089 ную к рибофлавину транспортную систему — рибофлавинпермеазу, Способ заключается в разделении не вступившего в реакцию с рибрфла5 винкиназой субстрата †рибофлавина и образовавшегося продукта реакцииФМН в результате связывания рибофлавина высокоспецифичной рибофлавинпермеазой с последующим эффективным транспортом рибофлавина в клети дрожжей. Рибодшавинпермеаза P.guilliermondii способна транспортировать в клетки дрожжей свободной рибофлавин и некоторые синтетические аналоги этого витамина, но не проявляет активности в отношении фосфорилированной формы рибофлавина, а именно рибофлавин-5 -фосфата-флавинмононуклеотида. После поглощения рибофлавина введенными в реакционную смесь дрожжевыми клетками он легко удаляется из реакционной смеси при помощи простых и доступных методов отделения клеток от жидкой фазы: центрифугированием, фильтрованием и т.д. После этого активность рибофлавинкиназы определяется непосредственным измерением флуоресценции исследуемой пробы по количеству образовавшегося в рибофлавинкиназной реакции ФМН °
Определение. активности рибофлавинкиназы согласно способу проводится не по уменьшению количества субстрата — рибофлавина, а по накоплению продукта ФМН, что является необходи35 мым условием при определении низких активностей исследуемого фермента.
Рибофлавинкиназа относится к таким ферментам, содержание которых в клетках микроорганизмов, в тканях растений и животных невелико и составляет
Зх10 -. Зх10 4 Е/мг белка.
Способ осуществляют следующим образом., 45
Составляют реакционную смесь для определения активности рибофлавинкиназы, содержащая рибофлавин, АТФ, ионы Mg + и компоненты буферной системы для создания оптимального значения рН; смесь прибавляют к исследуемой пробе и инкубируют, реакцию. останавливают термоинактивацией фер-: ментного белка, в реакционную смесь
Ъ вводят дрожжевые клетки и пробу инкубируют в течение определенного промежутка времени, после чего клетки
1 удаляют и активность рибодшавинкиназы определяют флуорометрией пробы, ) На чертеже приведен график зависимости флуоресценции реакционной смеси от активности рибодшавинкиназы в измеряемой. пробе.
Активность фермента определяют в реакционной смеси, содержащей рибофлавин в концентрации Зх10 М, АТФ—
3 х 10-4.М, MgS0< 1 х 10 М и 0,02
MNa — фосфатный буфер рН 8,0. Пробы инкубируют в течение 1 ч при 37 С и прогревают на кипящей водяной бане
5 мин. К охлажденным пробам добавляют дрожжевые клетки из расчета 10 мг клеток (сухой вес) на 1 мл пробы, после чего пробы инкубируют с перемешиванием 30 мин при 30 С и удаляют осадок центрифугированием при 1000 об/мин в течение 3 мин. В полученной надосадочной жидкости определяют концентрацию ФМН дшуорометрией пробы на электрофлуориметре ЭФ-ЗМ. Интенсивность флуоресценции исследуемой пробы возрастает линейно в зависимости от содержания рибофлавинкпназы в пробе в диапазоне от 4 х 10 до
24 х 10 Е/пробу (см.чертеж). За единицу активности (Е) рибофлавинкиназы принято количество фермента, необходимое для синтеза 1 мкмоль ФМН за
1 мин при 37 С.
В таблице приведены данные, полученные в результате определения активности рибофлавинкиназы в бесклеточных экстрактах ряда видов микроорганизмов, а также в частично очищенных препаратах этого фермента, полученных из штамма дрожжей P.guilliermondii АТСС 9058. Активность рибодшавинкиназы в эксперименте определяли двумя способами: 1 — предлагаемым способом, ? — способом, основанным на хроматографическом разделении субстрата и продукта рибофлавинкиназной реакции. Как видно из полученных данных, значения активности фермента в исследуемых пробах в обоих случаях определения практически не отличаются.
Клетки штамма дрожжей P.guilliermondii ВКПМ У-432, содержащие рибофлавиннермеазу, легко получить культивированием на простых минеральных средах с добавлением в качестве источника углерода углеводов (глюкозы, сахарозы), этилового спирта или парафинов нефти. Полученная биомасса дрожжей хорошо сохраняется в охлажденном состоянии без существенной потери рибофлавинпермеазной активнос5 163108 ти в течение ?0-30 сут. Для использования в данном способе дрожжевые клетки не требуют какой-либо предварительной обработки. Биомассу дрожжей получают культивированием штамма
P.guilliermondii ВКПИ У-432 в 500 мл колбах на качалке (200 об/мин) в среде, содержащей, r: сахароза 20, (NHy) Способ иллюстрируется следующими примерами: Пример 1. К исследуемой пробе объемом 0,5 мл, содержащей рибофлавинкиназу, прибавляют 0,5 мл 25 реакционной смеси, содержащей 6 х 10 И рибофланин, 6 х 10 M АТФ, 2 х 10 M MgS04,0,04 И На-фосфатный буфер рН 7,0 и пробу инкубируют при 37 С в-течение 30 мин. После инкубации пробу сразу же помещают в кипящую воду, на 5 мин и затем охлаждают. К пробе прибавляют 0,1 мл 0,5 M раствора КН РО и 0,1 мл водной суспензии дрожжей штамма P. guilliermondii ВКПИ У-432, содержащей 100 мг клеток (су хой вес) 1 мл. Пробу инкубируют с перемешиванием при 30 С в течение 30 мин и. центрифугируют 3 мин при 1000 об/мин. Затем 0,5 мл полученной надосадочной жидкости помещают в флуорометрическую кювету, доводят объем дистиллированной водой до 8 мл,и измеряют флуоресценцию раствора на электрофлуориметре ЗФ-ЗИ. Активность рибофлавин- 45 киназы в исследуемой пробе рассчитывают но формуле: Активность рибофлавинкиназы = =ФхК (Е), 9 6 где Ф вЂ” показания флуориметра в единицах флуоресценции; К вЂ” коэффициент пропорциональности; 1 -6 К = 8,5 х 10, если цена деления шкалы флуориметра установлена равной 0 01 мкг флавина. Например, показание флуориметра при определении активности рибофлавинкиназы в пробе равно 55 единиц флуоресценции. Тогда активность рибофлавинкиназы в исследуемой пробе составляет: 55 х 8,5 х 10 = 46,75 х 10 Г. Пример 2. Определение активности рибофлавинкиназы аналоги но описанному в примере 1 за исключением состава реакционной смеси, содержащей 5 х 10 M рибофпавин, 5 х 10 И АТФ, 1 х 10 M MgSO v 0,04 И Na- фосфатный буфер рН 8рО. Количественно определение активности рибофлавинкиназы в исследуемой пробе аналогично описанному в примере 1. Формула изобр ет ения Способ определения активности рибофлавинкиназы, предусматривающий инкубацию исследуемой пробы, содержащей фермент, рибофлавин, аденозин- I + 5 -трифосфат и ионы Mg, отделение субстрата — рибофлавина от продукта ферментативной реакции флавинмононуклеотида и измерение количества последнего в пробе, о т л и ч аю шийся тем,,что, с целью упрощения и удешевления способа, по окончании инкубации в реакционную смесь добавляют штамм дрожжей Pichia guilliermondii ВКПИ У-432, содержащий специфичную к рибофлавину транспортную систему рибофлавинпермеазу, а отделение рибофлавина осуществляют посредством транспорта рибофлавина в клетки дрожжей. 1631089 Исследуемая проба Активность рибофлавинкиназы, Е(Mr белка х 10, определенная по способу Предлагаемый Известный Бесклеточные экстракты, Brevibacterium flavum АТСС 13032 Bacillus subtili Shgv Hansenula polyanorpha ВНИИ Генетика МГ, 8 Candida boidinii ВСБ-719 Pichia guilliermondii АТСС 9058 Очищенные препараты фермента Осажпенньй (NH )<80 (0,4-0,9 ед. насыщения) Осажденный этиловым спиртом (50-8ОЖ) Фракционированный на сефадексе Г-100 4,3 19 0 4,2 19,0 3/,3 43,6 37 1 43,8 177,8 17,8 36,8 36,4 28,0 27,9 226,9 228,4 и в 50 f ьо 4 8 ХР Б 9) 24 kmrssecn рнбофиааыккнвэм в ирабв,B к IO Составитель А. Семенов Редактор М. Недолуженко Техред Л.Сердюкова Корректор И. Муска Заказ 524 Тираж 363 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101
