Способ определения фракций казеина молока

 

Изобретение относится к пищевой промышленности, а именно к аналитической и количественной биохимии, в частности к исследованию казеина в молоке. Цель изобретения - увеличение точности и упрощение способа. Для раетворения казеина и электролита элек- 1фоАоретической камеры используют барбиталовый буферный раствор с рН $,60-8,75, состоящий из 15,48 г бар- 0ктала натрия, 2,75 г барбитала на f л дистиллированной воды и 8,0 М мочевины , а для растворения геля агарагара используют смесь буферных растворов с рН 8,6-8,75, состоящую из барбиталового раствора, содержащего 30,96 г барбитала натрия, 5,50 г барбитала на 1 л дистиллированной в ды и 34,52 г триса, 4,80 г цитрата на 1 л дистиллированной воды с последующим добавлением к полученной смеси мочевины в количестве 8,0 М. Для электрофореза используют агар-агарi 1,4-1,5%-ной концентрации, толщиной 2,8-3,0 мм, размером 138x200 мм, приготовленного из 30,0 мл 3%-ного расплавленного при 70-80°С геля агарагара, барбиталового раствора в количестве 8,0 мл и трис-цитратного раствора в количестве 8,0 мл с той же температурой и 29,4 г мочевины, которые размешивают до образования однородной жидкости, при -этом казеин используют 6,8-7,2%-ной концентрации в количестве 0,019 мл в барбиталовом буферном растворе рН 8,60-8,75 и содержанием 8,0 М мочевины. cs «S

СООЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИК

0% m) (gg)g G 01 N 33/04

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ASTOPGHOMY СВИДЕТЕХЗЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4608820/13 (22) 17. 10.88

{46) 1 5. 05. 91 . Бюл . Р 18 (71) Украинский научно-исследовательский институт физиологии и биохимии сельскохозяйственных животных (72) l0.С.Клос и П.З.Лагодюк (53) 637. 148 (088 .8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 302663, кл. G 01 N 33/04, 1971. (54) СПОСОБ OITPFQEJIEIIIQI ФРАКЦИЙ КА3ЕИНА МОЛОКА (57) Изобретение относится к пищевой дромыипенности, а именно к аналитической и количественной биохимии, в уастности к исследованию казеина в вуюлоке. Цель изобретения — увеличение очности и упрощение способа. Для ра1 творения казеина и электролита элек1 уойоретической камеры используют фарбнталовый буферный раствор с рН ф:,60-8,75, состоящий из 15,48 r бар9итала натрия, 2,75 г барбитала на

Ф,л дистиллированной воды и 8,0 М моИзобретение относится к аналитической и количественной биохимии, в частности к исследованию казеннов молока.

Цель изобретения — увеличение точ, ности и упрощение способа °

Способ осуществляют следующим образом.

Для растворения казеина и электролита электрофоретической камеры ис„пользуют барбиталовый буферный раст2 чевины, а для растворения геля агарагара используют смесь буферных растворов с рН 8,6-8, 75, состоящую из барбиталового раствора, содержащего

30,96 г барбитала натрия, 5,50 г барбитала на 1 л дистиллированной в.,ды и 34,52 г триса, 4,80 г цитрата на

1 л дистиллированной воды с последующим добавлением к полученной смеси мочевины в количестве 8,0 H. Для электрофореза используют агар-агар

1,4-1,57, †н концентрации, толщиной

7 8-3,0 мм, размером 138 х200 мм, приготовленного из 30,0 юч З -нога расплавленного при 70-80 C геля агарагара, барбнталового раствора в количестве 8,0 мл и трис-цитратного раствора в количестве 8,0 мл с той же температурой и 29,4 r мочевины, которые размешивают до образования однородной жидкости, при этом казеин используют 6,8-7,22-ной концентрации в количестве 0,019 мл в барбиталовом буферном растворе рН 8,60-8,75 и содержанием 8,0 М мочевипы. вор с рН 8,60-8, 75, состоящий из

15,48 г барбитала натрия, 2,75 r барбитала на 1 л дистиллированной воды и 8,0 М мочевины, а для растворения р геля агар-агара используют смесь буферных растворов с рН 8,60-8,75, состоящую из барбиталового раствора, содержащего 30,96 г барбитала натрия, 5,5 г барбитала на 1 л дистиллирован ной воды и трис-цитратного раствора1 состоящего из 34,52 г триса, 3,8 г

1649427

4 раствора, разогретого до 80 С. После охлаждения раствора до 17 С объем

его доводят до 1 л барбиталовым буфет ром. Раствор казеина хранят в холодильнике при +2 С.

Агар-агар марки Корсаковский в количестве 30,0 г/л промывают дистиллированной водой встряхиванием на шутель аппарате 3-4 дня. Воду меняют

3 раза в сутки. Суспенэию агар-arape

2,5 ч расплавляют на кипящей водяной бане. Добавляют 0,001 г/л мертиолята.

Фильтруют через 10 слоев белой марли, разливают в стеклотару для одноразового использования. Закрытыми хранят впрок при 6 С в холодильнике.

Для растворения геля агар-агара используют смесь двух буферных растворов с рН 8,75, подогретую до 80 С, состоящую из барбиталового раствора, содержащего 30,96 r барбиталового натрия, 5,5 r барбитала на 1 л дистиллированной воды и 34,52 r триса, 4,8 r цитрата на 1 л дистиллированной воды в соотношении 1:1 с последующим добавлением к полученной смеси мочевины в количестве 8,0 М. цитрата на 1 л дистиллированной водь с последующим добавлением к полученной смеси мочевины в количестве 8,0N

При этом для электрофореэа использую агар-агар 1 4-1,5 -ной концентрации, толщиной 2,8-3,0 мм, размером 138$ 200 мм, приготовленного из 30 мл

3%-ного расплавленного до 70-80 С re о ля агар-агара, барбиталового раствор и трис-цитратного раствора в количестве 8,0 мл с той же температурой и

29,4 r мочевины, которые смешивают д образования однородной жидкости, а казеин используют 6,8-7,2 -ной концентрации в количестве 0,019 мл. Количественное определение фракций ка зеина проводят на микрофотометре с автоматической записью денситограм.

Барбиталовый буферный раствор в качестве электролита выгодно отличается своей стабильностью, поскольку один и тот же объем его можно исполь зовать для 10-12 электрофоретических раэгонок.

Дпя проведения одного анализа используется только 30 мп образца молока.

Применение геля агар-агара 1 «41,5 -ной концентрации в растворе двух буферов барбиталового и трисцитратного, 8,0 М мочевины в сочетании с использованием малого объема (0,019 мл) 6,8-7,2%-ной концентрации казеина в барбиталовом буферном растворе и 8,0 И мочевины способствуют глубокому расщеплению дисульфидных связей в структуре каэеина и четкому его делению на 16-18 отдельных фракций.

Пример. Общий казеин получают 40 из 30 мп свежего обезжиренного коровьего молока путем прибавления к нему смеси (1:1) 0,1 н. уксусной и соляной кислот при рН 4,6. Каэеин получают центрифугированием. Осадок казеина растворяют в 30 мл дистиллированной воды, центрифугируют. Процедуру повторяют 3 раза. Свободный от сывороточных белков казеин переосаждают

2 раза в 0,1 М растворе NaOH и О, 1 í. 50 растворе смеси 1:1 уксусной и соляной кислот. Затем казеин растворяют, в барбиталовом буферном растворе с рй 8,6, состоящем иэ 15,48 г барбитала натрии, 2,75 г барбитала на 1 л дистиллированной воды и 8,0 М мочевины. Дпя этого 480 г мочевины растворяют в 490 мл барбиталового буферного

Затем проводят электрофорез с использованием казеина 6,8-7,2 -ной концентрации в количестве 0,019 мл, агарагара с размером 138 к200 мм, приготовленного из 30 мл, З -ного расплавленного геля агар-агара при 80 С, баро биталового раствора в количестве

8,0 мл и трис-цитратного раствора в количестве 8,0 мл с той же температурой и 29,4 г мочевины, которые размешивают до образования однородной жидкости, наносят на фиксированную рамкой (138к200к3 мм) химически чистую стеклянную пластину (230к160" 2 мм) на столике. Последний, помещенный в бытовой холодильник с температурой 6 С, предварительно нивелируют по горизонту. Для лучшего сцепления блока агарагара со стеклом последнее покрывают тонким слоем З,О -ного расплавленного геля агар-агара и прогревают при 80 С.

Во избежание вытекания жидкого геля из рамки ее заплавляют с внутренней стороны раэогретьм З ;ным гелем агарагара при помощи пастеровской пипетки. Пластину с гелем оставляют в холодильнике на ночь до следующего утра. Во избежание возможного эамерзания и испарения геля его сверху эакрывают и утепляют.

Формула

16

Прозрачный твердый блок геля агарагара освобождают от рамки, ставят на трафарете, вырезают 8 лунок размером

10)<1,5 мм на расстоянии 6 мм одну от другой и 90 мм от катода (†). В каждую лунку микропипеткой вносят по

0,019 мл раствора 6,8-7,27-ного ка= зеина. Блок геля с материалом кладут на металлический столик с охлаждением проточной водой электрофоретической камеры.

Две кюветы электрофоретической камеры заполняют по 1 л барбиталовым буферным раствором с рН 8,75, состоящим из 15,48 г барбитала натрия, 2,75 г барбитала на 1 л дистиллированной воды и 8,0 М мочевины. Для этого 480,0 г мочевины растворяют в

490 мл барбиталового буферного раствора, ра зогр ет or о до 80 С. После охлаждения раствора до 17 С объем его о доводят до 1 л барбиталовым буферным раствором, Контакт между блоком геля агар-агара и буфером кювет электрофоретической камеры с платиновыми электродами осуществляют при помощи порблоновых мостиков-фитилей размером

150я63 3 мм. Электрофорез проводят при следующем режиме: 80  — 60 мин, 130  — 75 мин и 180  — 180 мин.

После окончания электрофореза стеклянную пластину с. гелем 36 ч фиксируют в 1 л 47.-ного раствора уксусной кислоты, сменяя его 2 раза. Отмытый гель сверху закрывают промоченной фильтровальной бумагой размером, соответствующим блоку, во избежание обо разования трещин, сушат при 37 С, красят 1 ч 17-ным раствором амидочерного 10 В на 7,0Х-ной уксусной кислоте. Затем отбеливают протеинограммы 2, OX-ным раствором уксусной кислоты с добавлением 27;ного глицерина. Количественное содержание каждой из 16-18 фракций казеина определяют сканированием (микрофотометр) с автоматическим самописцем и интегратором. Общий казеин согласно предложенному способу разделяется на 1618 четких фракций, которые соответствуют 6-9 фракциям Ф -казеннов, 2-3 фракциям К-казеннов, 3 фракциям Р-казеннов и 5-7 фракциям $ -казеинов.

Использование предлагаемого способа определения фракций казеина моло

49427

6 ка обеспечивает увеличение точности деления казеина на фракции и упрощение его выполнения, увеличение числа

5 четких фракций казенка молока до 1618, сокращение времени процесса электрофореза с 18,5 ч по прототипу до

5,25 ч, т.е. в 3,5 раза.

Количественное определение содержания фракций казеина на микрофотометре с автоматической записью денситограмм является объективным способом исследований, устраняет элемент ручной обработки электрофореграмм. изобретения

Способ определения фракций казеина молока, предусматривающий растворение

20 казеина, геля агар-агара, электролита электрофоретической камеры в буферном растворе, проведение электрофореза с использованием агар-агара и казеина и определение фракций казеина, о т

25лич ающийся тем, что, с целью увеличения точности и упрощения способа, для растворения казеина и электролита электрофоретической камеры используют барбиталовый буферный

3р раствор рН 8,6-8,75, состоящий из

15,48 r барбитала натрия, 2,75 r барбитала на 1 л дистиллированной воды и 8, О И мочевины, а для растворения геля агар-агара используют смесь буферных растворов с рН 8,6-8,75, сос35 тоящую из барбиталового раствора, содержащего 30,96 г барбитала натрия и

5,5 r барбитала на 1 л дистиллированной воды и трис-цитратного раствора, 4 состоящего из 34,52 г триса, 4,,8 r цитрата на 1 л дистиллированной воды с последующим добавлением к полученной смеси мочевины в количестве 8,0 К, а для электрофореза используют агар45 агар 1,4-1,5Е-ной концентрации, толщиной 2,8-3,0 мм, размером 138х200 мм, приготовленного из 30 мп З -ного расплавленного геля агар-агара при темо пературе 70-80 С, барбиталового раст-

50 вора .в количестве 8,0 мл и трис-цитратного раствора в количестве 8,0 мл с той же температурой и 29,4 r мочевины, которые размешивают до образования однородной жидкости, при этом казеин используют 6,8- 7,27-ной концентрации в количестве 0,019 мм.