Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l, используемый для получения моноклональных антител к днк- зависимой рнк-полимеразе бактериофага т7.
Изобретение относится к гибридобной технологии и вирусологии и может быть использовано для повышения качества выделяемого фермента эукариотической РНК-полимеразы. Целью изобретения является получение штамма гибридомы, продуцирующего моноклональные антитела (Мои AT) к РНК-полимеразе бактериофага Т7. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/C, иммунизированных очищенным препаратом РНК- полимеразы бактрериофага Т7 с клетками мышиной миеломы линии Х63. АГ8.653. Клетки культивируют в среде ДМЕМ с эмбриональной сывороткой коров (10%), глютамином (2 ммоль), пируватом натрия (1 ммоль), 2-меркаптоэтанолом
ССЮЗ СОВЕТСКИХ
РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 5/00 С 12 Р 21/08
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
flPH ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, «4 «.. .-..- .1 .« ":
Н ASTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ
f (21) 4б85569/13 (22) 25.04.89 (4б) 07. 04. 91 . Бюл. N - 13 (71) Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта (72) И.Л.Дегтярев, Д. А. Костюк и С.Н. Кочетков (53) 578 ° 085. 23 (088. 8) (5б} Carrol S.В., Stollar В.D. Proc. ,Nat,Acad. Sci,0SA V. 79, 1982, р. 7233-7237. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ MOHOKJIO.НАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ДНК-ЗАВИСИМОЙ РНКПОЛИМЕРАЗЕ БАКСЕ РИОФАГА Т7 (57) Изобретение относится к гибридобной технологии и вирусологии и может быть использовано для повышения качества выделяемого фермента зукариотиче ской РНК-полимеразы. Целью изобретения является получение штамма гибридомы, продуцирующего
Изобретение относится к гибридной технологии и вирусологии и может быть использовано для повышения качества выделяемого фермента эукарио-. . тической PHK-полимеразы.
Целью изобретения является получение штамма гибридома, продуцирунш1его моноклональные антитела (Мон АТ) к PHK-полимеразе бактериофага Т7.
Штамм получают следующим образом.
Восьминедельных мышей линии
BALB/С иммунизируют в пятки задних
„80„„1640156 А 1
2 моноклональные антитела (Мон AT) к
PHK-полимеразе бактериофага Т7.
Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/С, иммунизированных очищенным препаратом PHKполимеразы бактрериофага Т7 с клетками мышиной миеломы линии Хб 3. АГ8. 653.
Клетки культивируют в среде ДМЕМ с эмбриональной сывороткой коров (10%), глютамином (2 ммоль), пирув атом натрия (1 ммоль), 2-меркаптоэтанолом (О, 05 ммоль), пенициллином/стрептомицином (1000 ед./мл). Частота пасси рования 2-3 раза в неделю, посевная
1 доза 150 тыс. клеток на 1 мл, кратность посева 5" t0 раз. Продуктивность штамма 10 (по ELISA) в культуральной среде и 3 х 10 в асцитической жидкости. Мон AT, секретируемые штаммом, специфически взаимодействуют с PHK-полимеразой бактериофага Т7. Штамм депонирован под номером
ВСКК(П)-350D. Мон AT относятся к классу IgG1. лап по 35 мкг антигена с полым адьювантом Фрейнда. Через 4 нед. мышей иммунизируют подкожно в несколько мест вдоль спины, шеи, туловища
50 мкг антигена в неполном адьюванте Фрейнда. По истечении 4 нед. вводят 50 мкг антигена внутрибрюшинно без адьюванта. Через 10 дней неиммунных мышей линии BALB/Ñ летально облучают (750 рад) на рентгеновской установке, а через 24 ч после облучения нм внутривенно вводят лимфо1 640156 циты, полученные из селезенки иммунной мыши. Одновременно мышам подкла-:, дывают по 30 мкг антигена внутрибрю,,шинно. Четыре дня спустя после транс-. плантации лимфоцитов ставят слияние, Титр антител, специфичных и ДНКзависимой PHK-полимеразе бактериофага Т7, составляет в сыворотке подопытной.мьппи 1:2000 при определении с помощью твердофазного иммуноферментного анализа.
Слияние спленоцитов с клетками мышиной миеломы линии Х63.АГ8.653 проводят с помощью ПЭГ фирмы "Neck" (ФРГ) с мол.массой 4000. Отношение числа клеток миеломы к числу спленоцитов составляет 1:1. После слияния клетки вносят в лунки 96-луночных панелей. За 1 сут до слияния в лунки
96-луночных панелей высаживают селезеночные клетки (1 млн.кл/мл, по
1000 мкл на 1 лунку). Селекцию гибридных клонов проводят на среде ГАТ (Litllefield, I.n. Science, 1964, v. 145, р. 709-710} приготовленной на среде ДМЕМ с добавлением 20%-ной эмбриональной телячьей сыворотки и
40 мкг/мл антибиотика. гентамицина.
Клетки культивируют в инкубаторе с
67-ным содержанием СО в атмосфере.
Клоны гибридных клеток появляются через неделю в 60% лунок.
Через 14-17 дней тестируют культуральные жидкости из лунок с клонами на присутствие специальных антител методом непрямого твердофазного иммуноферментно го анализа.
Клониров ание положительных культур проводят методом предельных разведений, внося 0,5 клетки на одну. лунку 96-луночного лэйта с питающим слоем селезеночных клеток. Клон
ИМБ-4СЗ отобран как лучший продуцент моноклональных антител и повторно клонирован по описанной схеме. Один из .реклонов, характеризующийся максимальной активностью и образованием асцитных опухолей у 1007. привитых мышей BALB/C назван ИМБ-4СЗ.
Штамм клеток ИИБ-4СЗ депонирован во, Всесоюзной. коллекции клеточных культур Института цитологии AH СССР . под номером BCKK(II) Ф 8509.
Штамм характеризуется следующими
> приз наками.
Морфологические признаки. Суспензионная.культура, состоящая из крупных округлых клеток с крупными яд- рами и тонким ободком цитоплазмы.
Ядрьппки крупные, по 1-2 в ядре.
Культуральнйе признаки. Среда для
5 культивирования — среда ДИЕМ сывоЭ ротка эмбриона коровы (10%) сыворотка новорожденных телят (10%), глютамин (2 ммоль), пируват натрия (1 ммоль), 2-меркаптоэтанол (0,05 ммоль), пенициллин/стрептоцимин (1000 ед./мл). Характер ростастационарная суспензия. Метод снятиявстряхивание. Частота пассирования—
2-3 раза в неделю. Посевная доза
150 тыс. клеток на 1 мл. Кратность рассева 5-10 раз.
Контаминация, Бактерии, грибы и микоплазмы не обнаружены.
Культивирование in vivo. Культура прививается и растет в виде асциты в перитональной полости мьппей BALB/C.
За 7 дней до введения клеток мышамреципиентам вводят по 0,5 мл пристана. Асцит образуется через 10-14 сут
25 после введения 1-5 млн,клеток.
Продуктивность штамма. Первичная культура моноклональна. Проведено два клонирования. Все клоны позитивны. На протяжении 30 пассажей клона
ИМБ-4СЗ интенсивность продукции антител не изменилась (титр антител по
KLISA в культуральной среде 10, а в асцитической жидкости 3x10 ). Мон AT относится к классу иммуноглобулинов С1.
Консервация клеток. Клетки ИИБ-4СЗ заморожены на 36-м пассаже. Общее ко-личество ампул 20, по 4 млн. клеток в ампуле. Криозащитная среда — рос, товая среда с 50-60% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксила. Выживаемость при размораживании 9S%.
П р и и е р 1. Культивирование
45 гибридомных клеток ИИБ-4СЗ.
Во флаконы для культивирования клеток вносят гибридные клетки в концентрации 100-200 тыс. клеток в ° 1 мл среды ДИЕМ, содержащей эмбриональную сыворотку коровы (107}, сыворотку новорожденных телят (107), глютамин (2 ммоль), пируват натрия (1 ммоль),, 2-меркаптоэтанол (0,05 ммоль), пеницилин/стрептомицин 1000 ед. Клетки инкубируют 2-3 сут в стационарном
55 состоянии при 37 С в атмосфере 6%
0 СО . Концентрация клеток, превышающая 1 .млн. в 1 мл, неблагоприятна для роста клеток и вызывает их ги30
Фо рмула из о бре те н ия
Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus L
ВСКК(ХХ)-350D, используемый для получения моноклональных антител к
ДНК-зависимой РНК-полимеразе бактериофага 17.
Со став итель А.Маныкин
Редактор И.Дербак Техред Л,Олийнык Корректор A.0ñàóëåíêî
Заказ 997 Тираж 378 Подписное
ВНИИПИ 1 осударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101
5 16401 бель. Культуральную жидкость иэ флаконов с 3-дневной культурой тестируют на присутствие Мон AT. При посеве клетки встряхивают, разбавляют ростовой средой до указанной концентуации и разливают по флаконам.
Пример 2. Культивирование гибридомных клеток ИМБ-463.
Клетки, растущие в культуральных флаконах, через 1-2 сут после пересева центрифугируют 10 мин при
800 об/мин. Клетки должны быть в кон,центрации,не превьппающей 500 тыс./мл, т.е. находиться в логарифмической фазе роста. Клеточный остаток после центрифугирования ресуспендируют в определенном объеме культуральной среды без сыворотки и подсчитывают число жизнеспособных клеток с помощью 20 трипанового синего. Доводят концентрацию клеток до 1-10 млн/мл и вводят в брюшную полость мышей BALB/с, предварительно обработанных пристаном.
Обработку проводят однократно за 1- 25
3 недели до введения гибридомных кле ток путем инъекции 0,5 мл пристана.
Через 1-3 недели (в зависимости от числа введенных клеток) образуются асцитные опухоли у 100 привитых мьппей BALB/С. Количество асцитной жидкости, накапливающейся в брюшной полости мьппей после введения им гибридомных клеток ИМБ-4СЗ (в среднем
20 животным), составляет 5 мл. Содержание Мон AT в 1 мл асцитной жидкости составляет 10-20 мг.
Пример 3. Использование моноклональных антител ИМБ-4GЗ в иммуноферментном анализе.
Для определения активности взаимодействия ИЯБ-463 с антигенными детер56 б минантами ДНК-зависимой PHK"ïoëèèåразы бактериофага Т? применяют метод непрямого твердофаэного анализа.
В качестве твердой фазы используют
96-луночные пластинь;, сенсибилиэированные РНК-полимеразой фага Т7 (2,5 мкг/мл белка, по 100 мкл (раствора на лунку) ° Далее в лунки пластин вносят по 100 мкл раствора астической жидкости в необходимом разведении — в 10 мМ натрий-фосфатном буфере, содержащем 150 мМ NaC1, рН
7,4 (ЗФР). Для снижения неспецифического взаимодействия в ЗФР добавляют до 0,1Х детергента Твин-20 и до 0,2 бычьего сывороточного альбумина (ЭФР-AT). Пластины инкубируют 1 ч при 37 С и трижды промывают буфером ЗФР, соде ржащим О, 05 де те ргента Твин-20 (ЗФР-Т). После этого в лунки вносят по 100 мкл коньюгата кроличьих антител против иммуноглобулина мыши с пероксидазой хрена и инкубируют 1 ч при 3? С. После шестикратной промывки ЗФР-Т в лунки вносят хромагенный субстрат 0,005 М
2,2-азиноди-(3-этилбензтиаэолин-бсульфонат) (Н ) и 0,01 -ный Н 0 в
0,05 M цитратном буфере (рН 4,0). Оптическую плотность субстратной смеси в лунках регистрируют при 405 нм с помощью восьмиканального фотометра.
