Штамм культивируемых гибридных клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител против альфа- фетопротеина человека
Изобретение относится к гибридомной технопогин и может быть использовано для определения альфафетопротеина (АФИ) иммунорадиометрическим методом. Цель изобретения получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus inusculus L., продуцирующих моноклональные антитела (МонАТ) к АФП человека и животных . Ытамм получают гибридизацией клеток миеломы Х63..653 со спленоцитами мышей ВАЕВ/с, иммунизированньгх очищенным АФП человека, Штамм депонирован ВСКК (II) № 346.D. Штамм продуцирует МонАТ класса IftGI. Клетки культивируют в среде DMEM или RPMT 1640 с 15% сыворотки эмбриона коровы и стандартными добавками при 5% С02 в воздухе. Клетки перевивают in vivo через 3-4 дня с начальной плотностью ( 1-2) . Клетки рас-тут в организме сннгенцих мышей в виде асцитных опухолей. Титр МонАТ в асцитных жидкостях 10 при определении методом EITSA. S
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
Su бз о75
ФИИПН
g(Ti";.» »"?
ОПИСАНИЕ HSOEPETEHNR к двторСном г СвиДКткльетаМ
». 4, сы.
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4683257/13 (22) 31.03.89 (46) 28.02 91. 13юл. Е»" 8 (71) Всесоюзный онкологический науч— ный центр АМ!1 СССР (72) Л.К.Язова, А.И.Гусев, A.Â.AHäðååâ и Е.Ф.Якименко (53) 578.085.23 (088.8) (56) J. Immunn 1. i!et I»., 1988, "„106, р. 19 — 26. (54) ШТЛЕГЕ! КУЛЬ1 НЕЗИ РУЕ(1!ЫХ 1 И 13РЕЕЦЕЕЫХ
КЛЕТОК 1(ИЕЗОТЕН !Х MUS 1ГЦВСЕЕ1,US 1..
ПРОДУЦЕ .НТ 1!О!!О!ПО!ЕЛ. ЕЬЕЕЕ.ЕХ ЛНТИТЕтП
ПРОТIIВ ЛЛЕ>ФЛ вЂ” ФВTOIIP!ITI,IfIIA»Е! Е!013ЕКЛ (57) Изобретение относится к гибридомной технолог»»»» и может быть использовано для опрсдс.»ения альфа— фето»»ротсина (ЛФН) иммунорадиом< трическим методом. Це.»»> изобретения
Изобретение относится к гибри— домной технологии и может быть ис— пользовяно для определения содержания альфа-»beтопротеи»»а (ЛФП) в биологических жидкостях.
Цель изобретения — получение штамма гибридных кчльтив»»руеь»ь»х клеток животных ?Ius musculus f,,продуцирующего 11он Т к АФП человека и животных.
Мо»»АТ штамма реагирует с ЛФП человека, Mb»L»H теленка, свиньи и Ko»i»â€” ки и не реагирует с ЛФП собаки и крыЫтаж» получают следующим способом. (51) 5 С 12 N 5/00, С 12 Р 21/08
2 получение штамма гибридных купьтивируемь»х клеток животных Ius musculus
1, продуцирукнци моноклональные янтителя (11о»»ЛТ) к АФП человека и животных . Штамм получают гибр идиз ацией клеток миеломы Х63.Л88. 653 со спленоцитлми мьппей ВЛТ,13/с, иммунизированнь»х очищен»н и» ЛФП человека „Штамм депопировян ВСКК (II) ЕЕ 346.D. Штамм продуцирует ЕЕонЛТ класса IgG1. Клет-. ки культивируют в среде»»МЕЕ1 ит»и
1 Р! !T 1640 с 157 сывороткй эмбриона коровы и стандартными добавками при
57, СО в воздухе. Клстки перевивают
in vivo через 3 — 4 дня с начальной плотностью (1-2) ° 10 /мл. Клетки растут в организме с»п»ге»»ных мышей в виде лсцитных опухолей. Титр ЕЕо»»ЛТ в
Е3 лсцитных жидкостях 10 при определе— пни методом I:I..I SA.
Еьш»е»» линии ВЛТ,В/c иммуниз ир уют очищенным препаратом ЛФ!! челове а.
Лнтиген выделяют из смеси сывороток больных с гепятоцеллюлярным раком и тератобластомой методом лффинной хроматографии с использованием кроличьих антител к ЛФП, копъюгированных с СЕЕВг-активирова ной сефарозой 4В. Окончательную очистку антигена»»p ов од ят ме тодом яфф»»н ной хроматографии с использованием кроличьих антител к белкам сыворотки взрослого человека — эту процедуру повторяют дважды, что обеспечивает высокую (более 957) чис.тоту выделя1631075, ого антигена. Чистоту АФП контролируют с кроличьей антисывороткой к белкам сыворотки человека методом двойной иммунодиффуэии в геле. Полученный препарат смешива1от 1:1 с полным адъювантом Фрейнда. Каждой мыши вводят 15 мкг АФП в объеме 0,3 мл в шесть точек: подкожно на спине (4 точки по 0,05 мл) и внутримышечно в задние ноги (2х0,05 мл). Через месяц вводят 75 мкг АФП без адъюванта Фрейнда внутривенно (0,2 мл) и внутрибрюшинпо (0,2 мл). На четвертый день после второго введения антигена берут селезенку и суспензио спленоцитов гибридизуют с мы-Iшиной миеломой Х-63 Л,g 8.653. Для этого смесь спленоцитов и миеломы (6:5:1) в виде осадка инкубируют с
3 мл 50% полиэтиленгликоля (М.в. 1500 фирмы Merck-Schuchardt) в течение
2 мип, Обработанную смесь клеток ь,tcева1ог в две 96-луночные пластины (l,::nîп 3040) без фидера из расчеа 4>10 спленоцитов в .лунку или
4,6 10 смеси клеток в лунку.. Клетки культивируют в среде DMEM с добавле :::eM 20 лошадиной сыворотки, 2 мМ гл1отамина, 100 МК1 /мл гентамицина.
Селекцию гибридных клеток проводят в культуральной среде в присутствии гипоксантина (13, 6 мкг/мл), аминоптерина (0,19 мкг/мл) и тимндипа (3, 9 мкг/мл) . Появление колоний гибридных клеток зарегистрировано на
7-й день после слияния. На 13-й день после слияния множественные колонии (3-5 на лунку) выросли в 100 засеянных лунок, Скрининг проводят иммуноферментным методом с использованием конъюгата кроличьих антител к Ig(i мыши с пероксидазой хрена. В 99 лунок в супернатантах обнаружена специфическая анти-ЛФП активность. Клонирование и субклонирование позитивных гибридом проводят методом лимитирующих разведений, осуществляя поСев гибридом в количестве 3,1 и 0,5 клеток в лунку с заранее приготовленным фидером, В качестве фидера ис .пользуют клетки перитонеального экссудата мьппей BALB/с (5 10 клеток в лунку), Клонирование проводят на культуральной среде, содержащей 15 эмбриональной телячьей сыворотки. При реклонировании отмечалось 100 . позитив,ных клонов.
Полученный штамм гибридных клеток обозначен С2 — 84 и депонирован под номером ВСКК (II) У 3460.
Штамм характеризуется следующими свойствами.
Гибридому культивируют в среде (pH 7.2) ПИЕИ или RPMI 1640, содерж»вЂ” щей 15 эмбриональной телячьей сыворотки, 2 Ml" глютамина, 100 мкг/мл гентамицина, при 37 С в присутствии о
5 СО2 (в пластинах) или без СО (в
2 плотно закрытой посуде) . Для выращивания штамма можно испольэовать стеклянную или пластиковую посуду. Во флакон емкостью 25 смэ засевают в
7 мл ростовой среды 5 10 — 10 клеток штамма С2-84, Пассирование проводят один раз в 3-4 дня той же дозой клеток (без подсчета клеток их рассеивают из одного флакона на три). Титр антител в культуральной среде при определении иммуноферментным методом равен 2 ° 10 .
Для культивирования in viva мышам
BALB/с, сенсибилизированным пристаном (0,5 MJI внутрибрюшинно) за
7 дней до прививки гибридом, вводят внутрибрюшинно 5 ° 10 -10 клеток штам7 ма С2-84 в 2 мл среды PPHI с гептамицином. Асцитическую жидкость забирав ют у живых мышей по мере ее накопления, повторяя забор асцита у одной и той же мыши не менее 3 раз. Асцитный штамм перевивают на свежих мышей (> 10 — 10 клеток на мышь), проводя г, 6 7 не более трех пассажей. В пулах асцитов, полученных от разных животных и в разных взятиях, титр антител при определении иммуноферментным методом достигает значения 10
Иодальное число хромосом 79.
Продуктивность штамма. В 1 мл культуральной среды содержится не более 10-20 мкг антител, а в асцитической жидкости не менее 5 кг/мл антител.
Контаминация. Контаминация бактериями и грибами в штамме не обнаружена.
Криоконсервирование, Клетки штамма ресуспендируют в среде для замораживания, состоящей из эмбриональной телячьей сыворотки, РИЕМ или RPMI
1640 и диметилсульфоксида (5:4:1). б
5 10 клеток штамма смешивают с 1 мл, такой среды на холоде в пластиковых пробирках, для чего последние держат на льду и сразу же. после программного
5 1631 замораживания материала (1 /мин) помещают в хранилище с жидким азотом, Хранение в жидком азоте в течение нескольких лет обеспечивает почти
907. выживаемость клеток (визуальная оценка). Клетки штамма выдерживают хранение и при -70аС, но короткое по времени (до 1 месяца).
Размораживание штамма проводят а в водяной бане при 37 С в течение
2-3 мин> после чего клетку отмывают центрифугированием от среды для замораживания и переводят в обычную культуральную среду, Характеристика целевого продукта.
МонЛТ, продуцируемые штаммом С2-84> от нос я тс я к подкла с су мышиных и1 муноглобулинов 1я01. Константа связы— вания антител штамма С2 — 84 с ЛФП ðaâна 1 ° 10 л/моль. Определение прове9 дено жидкофразным радиоиммунологическим методом. Взаимодействие ИонАТ с АФП может быть определено имму— ноферментным и радиоиммунологическим методами, а также методом иммуноизотахофореза на ацетатцеллюлозной мембране и методом смешанной преципитации в геле. МонЛТ G2 — 84 способны связываться с ЛФП, находящимся в растворе и иммобилизованным на твердой фазе, а также и в том случае, когда само tIoHAT С2 — 84 прикреплено к носителю, например, к пластику.
В методе двойной иммунодиффузни в геле ИонАТ С2 — 84 ЛФП не преципитирует. 1При анализе с АФП различных видов млекопитающих МонЛТ С2 — 84 реагирует с с ЛФП человека, мьш и, теленка, свиньи и кошки и не реагирует с ЛФП крысы и собаки. По результатам иммуноферментного анализа С2 — 84 обладает практически одинаковым сродством к ЛФП от больных первичным раком печени и к АФП эмбрионального происхождения. С ЛФП от больных с тератобластомами ИонЛТ С2-84 связывается несколько слабее. С антигеном связывается в присутствии ИонЛТ D1084 и F2-84, что свидетельствует об отсутствий перекрестной реактивности между данными МонЛТ, Использование штамма С2-84 иллюстрируется следующим примером.
Пример. Использование МонАТ
С2-84 в смеси с другим ИонЛТ D10 — 84 в иммунорадиометрическом методе для определения АФП.
075
Смесь пву МонЛТ сор бпруется на твердой Лазе.
Тверлой подложкой служит поверхность лунок полихлорвинил» вых плат. ,пчя иммобилизации МонЛТ в л í,àõ инкубируют смесь асцитических жидкостей
С2-34 и D10 — 84 в 0,08 М растворе
Ila С2-84 и 010-84 в лунках равно 1:20001:3000. После удаления содержимого; лунки двукратно промывают забуференным физиологическим раствором (ЗФР) рН 7,3-7,5, содержащим 1-2 ло— шадиной сыворотки (ЗФР— ЧС). Блокировку свободных участков полихлорвинила проводят с помощью третьей порции ЗФР-ЛС (230 мкл) в течение 1,5-2 ч при комнатной температуре После 2-3 †кратн промывки под стру-ей водопроводной воды лунки с иммобилизованными Мо«АТ используют в качестве твердой фазы. Для сравнительной оценки эффективности связывания смеси МонАТ С2-84 и D10 — 84 аналогичным образом готовят твердую фазу с МонЛТ D10-84 и С2-84 отдельно. Конечное разведение амниотических жидкостей С2-84 и D10 — 84 равно 1:1300 †:2000. Пригодность твердой фазы определяют путом построения кривой стандартов ЛФП. 11лл этого используют стандарты ЛФП из коммерческого набора или ам,шотиче скую жидкость с известным содержанием ЛФП, а также ме-" ченные I кроличьи антитела к АФП и буферный раствор из набора или ЗФР-ЛС, Иммунорадиометрическое определение ЛФП проводят в два этапа. Сначала в лунках с иммобилизованными МонАТ инкубируют стандарты АФП (180 мкл) при комнатной температуре (не менее 912 ч) или при 37 С (3 — 4 ч). Затем содержимое лунок удаляют и лунки промывают 3 — 5 раз под струей водопроводной воды. На втором этапе связавшийся твердой фазой ЛФП проявляют мечеными антителами (200 мкл) в течение 16 — 20 ч при комнатной темпео ратуре или при 37 С. Содержимое лунок отсасывают в сборник радиоактивных отходов. Лунки промывают 3-5 раз под струей водопроводной воды, плату высушивают на воздухе и разрезают, Вырезанные лунки помещают в счетные 1631075 Формула изобретения штамм культивируемых гибридных 1Д клеток животных Мпз mu:=. =п1с- . BCKI-". (II) ¹ 3460 — п с прсдуцент моноклональных антител против альфа-фетопротелна человека. Составитель Г.Игнатьева Техред Л.Сердюкова Корректор М.Лемчик Редактор Л,Пчолинская Заказ 523 Тираж 369 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Ужгород, ул. Гагарина,101 пробирки для / -счета. Определив скорость счета (имп/мин) в объеме 200 мкл (Т вЂ” общая метка), для каж- " дого стандарта рассчитывают величину связывания метки (В/Т 1007) и строят 5 калибровочную кривую. При использовании смеси МонАТ С2-84 и D10-84 в качестве твердой фазы определяемая концентрация АФП лежит в диапазоне от 1-5 до 80 нг/мл, тогда как те же МонАТ, взятые по отдельности, существенно ус тупею р в данном методе по чувствительности определения АФП смеси МопЛТ.
