Штамм бактерий рrотеus vulgaris-продуцент рестриктазы р @ ii

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу рестрикции Pvu II, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5J- CAGCTG-3. Штамм Proteus vulgaris

СОЮЗ СОВЕТСХИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСХИХ

РЕСПУБЛИН

„„gg„„632974 (5))g С 12 И 9/14, 1/20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ХОМИТЕТ

IlO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4304 715/13 (22) 28.09.87 (46) 07.03.91. Бюл. № 9 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) С.Х. Дегтярев, В.Е. Репин и Н.И. Речкунова, (53) 577.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1552639, кл. С 12 N 1/14, 1987 ° (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ PROTEUS VULGARIS — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗН PVU II (57) Изобретение относится к биотех-. нологии и касается получения нового

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения нового штамма, продуцнрующего сайт-специфическую эндонуклеазу, способную. узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 -CAGCTG-3, данный ! ). сайт узнавания является единственным в ДНК плазмиды рВ R и ряде челноч322 ных плазмид (41р5, 4RP17, 4Ер2), что определяет возможность широкого использования этой рестриктазы.

Цель изобретения — выявление штамма-продуцента Proteus vulgar is

В-3671 (84), нетребовательного к питательным средам и синтезирующего одну сайт-специфическую эндонуклеазу, способную узнавать и расщеплять пос2 штамма, продуцирующего сайт-специфическую эндонуклеазу рестрикции

Pvu II, узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5

CAGCTG-3 . Штамм Proteus vulgaris (84) BKIIH В-3671 — продуцент рестриктазы Pvu II вьделен как контаминант при глубинном культивировании гемофильных микроорганизмов. Штамм нетребователен к питательным средам, селективно продуцирует одну рестриктазу Pvu II с выходом 80000-100000 ед/г

7 что в 2-2,5 раза превышает известный.

Продолжительность культивирования в

1,5 раза меньше, чем в известном способе. ледовательность нуклеотидов 5 CaGCTG-3 с более высоким выходом.

Штамм выделен как контаминант при глубинном культивировании гемофильных микроорганизмов.

Штамм Proteus vulgaris 84 характеризуется следующими признаками .

Морфологические признаки.

Клетки палочковидные размером 0,50,6 мкм на 1,0-2,5 мкм, прямые или почти прямые, в стационарной фазе имеется вариабельность по размерам.

Не образуют эндоспор. Беспигментный, грамотрицательный.

Физиологические признаки. факультативный анаэроб, усваивает гЛюкозу с образованием кислоты и га163 29 74 за, выделяет Н S индолположитепьный разжижает желатину, дезаминирует фенилала нин, катала з опол ожит ель ный. От типового вида Proteus vulgaris отличается по способности сбраживать маннозу и ксилозу.

Культуральные признаки.

Хорошо,растет на обычных комплексных питательных средах (СПА„ МПБ) 10 при.температурах 30-37 С и рН 6,87;О. Колонии на агаризованных средах округлые, сероватого оттенка, края ровные. При культивировании дает специфический запах. 15

Хранение штамма осуществляют под вазелиновым маслом, в растворе глицерина при -70 С или в лиофильновысушенном состоянии.

Биотехнологические свойства штам- 20 ма.

При исследовании биомассы в ней обнаружена и выделена рестриктаза

Pvu II, способная узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 25

5 -CAGCTG-3, Для глубинного культивирования используется доступная дешевая среда на основе рыбного гидролизата, вместо пептоносолевой среды. Предлагаемый штамм характеризуется высоким выходом рестриктазы Pvu II составляющим 80-100 тыс.е.а./г (в 2 раза больше, чем у известного штамма).

Пример 1 ° Клетки Proteus vul- 35

garis 84 бактериологической петлей пересевают на чашки Петри с агаризованной средой (на основе 3,5%-ного рыбного гидролизата), содержащей

1% Hóå донорскую кровь Чашки с за 40 сеянной культурой инкубируют в термостате при 30 С 16 ч. Подросшую культуру переносят в жидкую питательную среду следующего состава: рыбный гидролизат 3,5%, вода дистиллированная 45 остальное, рН 7; 2. Культивирование осуществляют в термостатированных качалках при 30 С; -200 об./мин, до стационарной фазы роста .

Глубинное культивирование проводят в ферментере "Microferm" в анао логичной среде при 30 С, аэрации 1 объем в минуту, 200 об./мин мешалки.

В течение культивирования следят за поддержанием рН и оптической плотностью. При достижении ранней стацио55 нарной фазы роста (оптическая плотность sso = 2,7) культивирование прекращают. Биомассу осаждают центрифугированием. Выход биомассы составляет

3,7 г/л..

Замороженную или сырую биомассу

Proteus vulgaris 84 в количестве

10 г переносят в стакан вместимостью 50 мп, добавляют 30 мл буфера А, содержащего 0,02М КН РО4, 0,001 М ЭДТА; 0,01 М 2-меркаптоэтанол, рН 7,0. Содержимое стакана суспендируют на магнитной мешалке до получения однородной суспензии. Ее обрабатывают ультразвуком пять раз по 40 с (ультразвуковой дезинтегратор MSE), мощность 200-300 Вт, частота 20 кГц, амплитуда 14 мкм) с охлаждением на ледяной бане. Клеточный дебрис отделяют центрифугированием, 1600 об./мин, 30 мин, центрифуга I-21.

30 мл осветленного лизата наносят на колонку с 100 смэ фосфоцеллюпозы

P-11. Сорбированный материал элюируют буфером Б (0,02 M КН РО4, 0,01 M

2-меркаптоэтанол; 0,001 M ЭДТА; 1 M

NaCl, рН 7,0) до тех пор, пока поглощение элюата не станет равным поглощению буфером Б. Объем смыва 200 мл.

Смыв переносят в диализные мешки . и диализуют против буфера А (3 л по

8 ч). Супернатант после диализа наносят на колонку с ДЕАЕ-целлюлозой объемом 8 смз со скоростью 20 мл/ч.

Колонку промывают буфером А. Фермент элюируют линейным градиентом концентрации 0-1 М NaC1, объем градиента

100 мл. Элюат собирают фракциями по 5,0 мл. Фракции, содержащие фермент, объединяют и диализуют против буфера А (3 л) в течение 16 ч, нано .ь сят на колонку с фосфоцеллюлозой

P-11 объемом 4,5 смэ . Фермент элюируют линейным градиентом 0-1 M NaC1.

Объем градиента 50 мл. Элюат собирают по 1 мл фракциями, общий объем

10 мл. Полученный препарат диализуют в течение 16 ч против 400 мп буфера Б.

Выход рестриктазы Pvu II составляет

100 тыс.е.а./r.

Пример 2. Культивирование биомассы и выделение фермента прово-: дили как и в примере 1 но использовали предварительный пассаж на агаризованной среде без добавления крови.

Выход фермента составил 20 тыс.е.а./r.

Пример 3. Получение фермента проводили как в примере 1, но при пассировании штамма Proteus vulgaris

84 В-3671 на агаризованной среде при16329

Составитель И. Привалова

Редактор Н. Яцола Техред Л.Олийнык Корректор Л. Патай

Заказ 596 Тираж 366 Подписное

В11ИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул. Гагарина, 101 меняли 0,5X-ную донорскую кровь. Вы-: ход фермента составил 80 тыс.е.а./г.

Пример 4. Пассирование проводили как в примере 1, но при концентрации крови 1,5Х. Наблюдали угнетение роста, выход биомассы составил

3 г/л. Выход рестриктазы 90 тыс. е.а./г, Пример 5. Получение фермента проводили как в примере 2, но 10 использовали концентрацию рыбного гидролизата 4Х. Выход фермента не изменялся, но наблюдается уменьшение урожая биомассы до 3,2 г/л.

74 6

Полученный штамм обладает следующими преимуществами по сравнению с известным. содержит одну сайт-специфическую эндонуклеазу рестрикции

Pvu II, продуцирует в 2,5 раза больше целевого фермента, чем известный штамм, нетребователен к питательным средам, а также устойчив при хранении в различных условиях.

Формула изобр ет ения

Штамм бактерий Proteus vulgaris

ВКПМ В-3671 — продуцент рестриктазы

Pvu II.