Штамм бактерий еsснеriснiа coli rfl - продуцент рестриктазы е со 105i

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано как инструмент для получения фрагментов ДНК, картирования молекул ДНК и конструирования векторных молекул ДНК. Цель изобретения - получение штамма Escherichia coli RFL ВКПМ В-4500 (105) - продуцента рестриктазы , узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 TACGTA, с высокой активностью. При культивировании на питательной среде, содержащей , г/л дистиллированной воды: пептон ферментгт вный 10,0; дрожжевой экстракт 5,0; КяС1 10,0; рН 7С0- 7,2 до конца фазы экспоненциального роста получают бактериальную массу с выходом 2,7-3,5 г с 1 л среды. Из 1 г биомассы получают 2000 ед. рестриктазы Е-со 105 I. 1 табл. «

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (111 (51) С 12 11 9/14, 1/20, ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОР(;ЙОМЪ СВИДЕТЕЛЬСВ 7ВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬПИЯМ

ПРИ fHHT СССР (21) 4673405/13 (22) 07.02.89 (46) 28.02.91. Бюл. Р 8 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологии (72) Д.З. Степонавичене,- Э.П. Манелене, Э.-Л.Н. Кюдулене, Y..Ï.Пятрушите, В.В.Буткус и Э.-А.А.Янулайтис (53) 577.15(088.8) (56) Каталог фирмы "Био-Лабе", 1988, с. 31. (54) ШТИК БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA СОЫ

RFL — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗИ F. СО 105 I. (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано как инструмент для получения фрагменИзобретение относится к биотехнологии и представляет собой штамм, продуцирующий сайт-специфическую эндонуклеазу E со 105 I, используемую как инструмент для получения фрагментом ДНК, картирования молекул

ДНК и конструирования векторных молекул ДНК.

Цель изобретения — получение штамма Escherichia coli RFL BKllN 8-4500 (1Î5) — продуцента рестриктазы, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотндов 5 TACGTA, с высокой активностью.

Итамм Escherichia coli RFL 105 характеризуется следующими признаками.

Морфологические: клетки палочковидные, окрашенные фуксином клетки располагаются поодиночке, -попарно или в коротких цепочках, грамотрицательны.

Неподвижны.

2 тов ДНК, картпрования молекул ДНК и конструирования векторных молекул

ДНК. Цель изобретения — получение штамма Escherichia coli RFL BKI21

В-4500 (105) — прадуцента рестриктазы, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 TACGTA, с высокой активностью. При культивировании на питательной среде, содержащей, г/л дистиллированной воды: пептон ферментвт".вный 10,0; дрожжевой экстракт 5,0 1-".""-.Cl 10, О; рН 7,07,2 до конца фазы экспоненциального роста получают бактериальную массу с выходом 2,7-3,5 г с 1 л среди.

Из 1 г биомассы получают 2000 ед„ рестриктазы Е.со 105 I. 1 табл.

Культуральные: на питательном агаре через 18-20 ч. роста образуют круглые, с ровным краем, блестящие, белосероватые колонии. При росте на питательном бульоне вызывают равномерное помутнение.

Физиологические и биохимические:

-факультативный анаэроб, температурный оптиум 37 С, рН среды 6,8-7,3.

Ферментирует до кислотообразования глюкозу, сахарозу и лактозу. Не образует сероводород, образует индол.

При росте не усваивает мочевину, на среде Симонса не растет.

Нтамм хранится в лиофильно-высушенном состоянии.и на мясопептонном

arape под слоем -стерильного вазежнового масла.

Для культивирования F..cali RFL

105 применяют питательную среду сле163108 1 дующего состава, г/л дистиллированной воды:

Пептон ферментативный 10,0

Дрожжевой экстракт 5,0

NaC1 10,0 рН 7,0-7,2

Культивирование! проводят при температуре 37 С, рН 6,8-7,3, с хорошей аэрацией до выхода клеток в позд- 10 нюю логарифмическую фазу роста.

Итамм Escherichia coli RFL 105 продуцирует в высоких количествах рестриктазу Е со 105 I узнающую и расщепляющую последовательность нуклеотидов 5 TACGTA. !

Рестриктаза характеризуется следующими свойствами: узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов

5>ТАС ТА в молекуле ДНК; оптимальное

Ф значение рН для действия рестриктазы

7,8-8,0; оптимальная температура действия 37-38 С, для активности рест0 риктазы требуются ионы Мя+ ; оптимальная концентрация Mg+е 3-5 мМ.

Пример 1. Получение биомассы F.coli RFI. 105.

Для получения биомассы Escherichia coli RFI, 105 используют лабора-, торный ферментер "Биолафит" (Франция), рН-метр, термэстат, круговые качалки, спектрофотометр СФ-26, лабораторную центрифугу гипа ЦЕПА (ФРГ), бокс ламинарный, автоклав, дистиллятор.

Глубинное культивирование бактерий проводят на питательной среде (РН 7,3) следующего состава, г/л:

Пептон ферментативный 10,0

Дрожжевой экстракт 5,0

ИаС1 10,0 40

Вода дистиллированная Остальное

Инокулят готовят в колбы с 250 мл питательной среды из расчета 0,10,2Х суспензии бактерий, полученной при выращивании в 5 мл мясопептонного бульона в течение 3-4 ч (засеяно бактериологической петлей). Ночной инокулят в объеме 500 мл засевают в лабораторный ферментер емкостью

20 л (коэффициент заполнения 0,5).

Культивирование проводят 4-5 ч до конца фазы экспоненциального роста.

В процессе культивирования автоматиМ .чески поддерживают рН на уровне 7,01

« 0.,3 путем подачи 20Х-ного раствора

Ф

Na0H и изменения .числа оборотов Мешалки с 200 до 400 об/мин, температура 3710,1 С. Бактериальную массу собирают посредством центрифугирования на проточной центрифуге типа ПЕЛА (ФРГ) при 23000-25000 об/мин, фасуют ее и хранят при -20 2 С, Урожай клеток составляет 2,7-3,5 г влажной биомассы с 1 л питательной среды.

Пример 2. Выделение сайтспецифической эндонуклеазы рестрикции Е со 105 I.

Для выделения и очистки рестриктазы используют ультразвуковой дезинтегратор УЗДН-2Т (СССР), центрифугу

Бекман Ж-21С холодильную камеру

"Колора", хроматографические колонки, термостат, аппарат для электрофореза, универсальный источник питания !

УИП-1 .

ДНК фага А выделена по известной методике (Saito Н. I4iura К.3. Biochem.

Biophys Асtа, 1963, 72, 619-629). Используется гликоль бОСО, декстран 500 фирмы "Serva".

Активность рестриктазы тестируют методом гидролиза ДНК фага Я с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в агарозном геле. Реакционная смесь для гидролиза содержит 10 мМ трис HCl рН 7,8, 20 мМ NaC1 5 мМ NgCL, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 100 мкг/мл альбумина бычьей сыворотки, 2 мкг ДНК фага Я в 40 мкл смеси и 1 мкл фермента. Реакцию проводят при 37 С 10 мин, Электрофорез проводят в 0,1 М натрийборатном буфере (рН 8,2) 2 мМ трилон Б, в течение 1,5 ч при напряжении (00 B и силе тока 100 . Окрашенные этидийбромидом (1 мкг/мл) гели просматривают в УФ-свете.

3а условную единицу принимается то количество фермента, которое в оптимальных условиях за 1 ч полностью расщепляют 1 мкг ДНК фага h

Все операции по выделению и очистке фермента проводят при +4 С.

10 r влажной биомассы суспендируют в 20 мл буфера А (10 мМ трис-НС1-буфер, рН 7,8, содержащий 10 мМ 2-меркаптоэтанола), озвучивают на дезинтеграторе. В полученный бесклеточный экстракт добавляют полиэтиленгликоль (28,47) и декстран (7,17) добавляют

NaC1 до конечной концентрации 0,5 М.

Все хорошо перемешивают на магнитной мешалке и центрифугируют со скоростью

4000 об/мин 30 мин. После центрифугирования верхний слой сливают и диализуют против буфера Е (10 мМ калийфос5 163 фатный буфер, рН 7,4, содержащий 1 мМ

ЭДТА, 7 мИ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ фенилметилсульфокилфторида (PMSF), содержащего 0,1 M NaC1 После диалиba ферментный раствор наносят на кслонку с фосфоцеллюлозой Р11 (1,5х х12 см), уравновешенной буфером Б, 0,1 И NaC1. Колонку промывают этим же буфером и элюируют линейно новышающейся концентрацией ИаС1 от 0,1 до 0,6 М и 300 мл буфера Б. Фракции, содержащие основную часть активности, объединяют и диализуют в течение 16 ч против буфера Б, 0,1 M ИаС1. После диализа ферментный раствор наносят на колонку с ДНК-агарозой (1х12 см), уравновешенной буфером Б, 0,1 М NaC1.

Промывают этим же буфером и элюируют линейно повышавшейся концентрацией

NaC1 от О,i M до 0,5 И в 140 мл буфера Б. Активные фракции объедикяют и диализуют н течение 16 ч против буфера Б (10 мМ калийфосфаткый буфер рН 7,4„ содержащий 1 мМ ЭДТА, 7 мМ

2-меркаптоэтанола, 1 мМ РМБР). Ферментный раствор после диализа наносят на колонку с гепаринсефарозой (1х8 см) уравновешенной буфером Б. Промывают этим же буфером и элюируют линейно повышающейся концентрацией NaC1 от О до 0,5 М в 100 мл буфера Б. Активные фракции объединяют и диализуют в течение 16 часов против буфера "- 0,1 М

NaC1. После диализа ферментный раствор наносят на колонку с голубой сефарозой (1х7 см) уравковешенной этим же буфером. Колонку промывают буфером Б, 0,1 М NaC1 и элюируют линейно повышающей концентрацией NaC1 от

0,1 M до 0,7 М в 100 мл буфера Б.

Фракции, содержащие основную часть рестриктазной активности, объединяют и диализуют против буфера Б:

i0 мМ трис=НС1 рН 7.4,1 мМ ДТТ,, 1 мМ

ЭДТА,"0,1 М КС1, 50% глицерина, 1 мМ

PMSF и 200 мг/мг альбумина бычьей сыворотки. Ферментный препарат хранят при -20 С. Из 1 r сырой биомассы получают 2000 ед.рестриктазы Е со

105 I.

Определение специфичности.

Было установлено, что Е со 105 I расщепляет ДНК фага Q u fd в одном месте и не действует на ДНК Р х 174 и рВЙ 322. Рассмотрение табличных данных позволило выявить только одну последовательность нуклеотидов

5 GC

Есо 105I

3 CG

20

Используют самокоплементарные олигонуклеотиды. Каждый из меченых дуплетов обрабатывали рестриктазой

Е со 105 I и продукт расщепления анализировали в тонком слое ДЭАЭцеллюлозы. В параллельных дорожках анализировали частичный 3 -экзонукле30 азкый гидролизат - -ченого олигонуклеотида, входящего в состав исследуемого дуплекса. Наличие полного статистического набора продуктов экзону- клеазного гидролиза контролировали

35 путем его анализа методом нуклеотидных карт.

Для рестриктазы Е со 105 I меченым продуктом расщепления дуплекса зь оказался пектакуклеотид 5 — Ф GCTAC, 40 что свидетельствует о расщеплении узнаваемого гексануклеотида в местах

Ф

5 -ТАС GTA

3 -ATG CAT указанных стрелками.

Предлагаемый штамм позволяет получить высокоочищенный ферментный препарат с большим выходом (2000 ед./r биомассы).

Формула изобретения

Шгамм бактерий Fscherichia coli

RFL BIG1M B-4500 — продуцент рестрик тазы Е со 105 I.

1081

5 TACGTA, узнаваемую рестриктазой

Sna BI удовлетворяющую указанным экспериментальным данным.

Совокупность данных, представленных в таблице, убеждают, что субстратом Е со 105 I является гексануклеотид 5 -ТАСГТА.

Наличие сведений о структуре участка, узнаваемого рестриктазой Е со

105 I, послужило предпосылкой для апробации в опытах по определению места расщепления ДПК этим ферментом подхода, основанного на использовании в качестве субстрата синтетического олигонуклеотида, содержащего сайт узнавания (обведено рамкой) этого . фермента:

1631081

Сравнение расчетных и экспериментальных данных характера расщепления фрагментов ДНК фагов Я и fd рестриктазой Е со 105 I

Субстрат

Величины фрагментов. образующихся под действием Е со 105 I (п.н.) Длина фрагмента, расщепленного

F. со 105 I (п.н.) р э

Sma I фрагменты

ДНК фага Я

Bam H I фрагменты

ДНК фага Я

12189

12200

19387

10157

6684

6700

16841

Нас 1 фрагменты

ДНК

20040

12189

7851

8000

Bcn I фрагменты

ДНК фага fd

1681

655

640

2336

Bam HI фрагменты

ДНК фага fd

2031

952

940

2983

П р и м е ч а н и е. P — величины фрагментов рассчитаны на основе известной структуры ДНК фагов ф (Sanger F.J. Мо1.Biol., 1982, 162, 729-773) и fd (Beck Е.Nucl, Acids Rcs., 1978. 5, 4495-4503), исходя из предположения, что E со 105 I узнает гексануклеотид 5 -TACGTA.

Э вЂ” величины фрагментов установлены методом относительной электрофоретической подвижности.

Составитель И. Привалов

Редактор Л. Пчолинская Техред Л.Сердюкова Корректор А. Осауленко

Производственно-издательский комбинат "Патент™, r.Ужгород, ул. Гагарина, 101

Заказ 524 Тираж 364 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5