Штамм бактерий bacillus меgатеriuм - продуцент рестриктазы вме 361 i

 

Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии. Целью изобретения является получение нового штамма Bacillus megaterium ВКПМ В-4723(361), синтезирующего рестриктазу Вте 361 1с повышенным выходом. Штамм выделен из почвы в результате поиска штаммов - продуцентов рестриктаз среди почвенных бактерий, нетребователен к питательным средам, не патогенен для человека, позволяет повысить выход рестриктазь Вте 361 I, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидон GGCC, в 10 раз с 1 л культуры. Ытамм обеспечивает повышенный выход рестриктазы, составляющей 100000 ед./г биомассы. Для культивирования В. megaterium 361 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной воды: пептон 10; дрожжевой экстракт 5, NaCl 10. Культивирование проводят при температуре 30°С с хорошей аэрацией в течение 24 ч. 1 табл. а 8

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

А1 (19) (11) (У1) С 12 N 9/14, 1/20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯ14

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4672312/1 3 (22) 13.02.89 (46) 28.02.91. Бюл. ) - 8 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) И.С.Андреева, Л.P. Лебедев, Г.Д. Серов и Н.И.Пустошилова (53) 577.15(088.8) (56) Kiss А., Sain В., Csordas-toht E., Venetianer P., А new seguence — specific endonuclease (Bsp) from Bacillus sphaericus. — Gene, 1977, v. 1, р. 323-329. (54) ШТА1"П"1 БАКТЕРИЙ ВАСП.LUS MECATERIUM — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ БИГ

361 I (57) Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии. Целью изобретения является получение новоИзобретение относится к микробио-, логии и генной инженерии, в частности к получению рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов СГСС.

Цель изобретения — получение нового штамма Bacillus megaterium ВКПМ

В-4723 (361), нетребовательного к питательным средам и синтезирующего рестриктазу, способную узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GGCC, .с высоким выходом.

Штамм Bacillus megaterium 361 выделен из почвы в, результате поиска

I штаммов-продуцентов рестриктаз среди почвенных бактерий, 2 го штамма Bacillus megaterium BKliN

В-4723(361), синт зирующего рестриктазу Bme 361 I c повышенным выходом, Штамм вьщелен из почвы в результате поиска штаммов — продуцентов рестриктаз среди почвенных бактерий, нетребователен к питательным средам, не патогенен для человека, позволяет повысить выход рестриктазы Bme 361 I, узнающей и расщепляюшей последовательность нуклеотидов GGCC, в 10 раз с 1 л культуры. Штамм обеспечивает повышенный выход рестриктазы, составляющей 100000 ед./г биомассы. Для культивирования В. megaterium 361 применяют питательную среду следующего состава, r/ë дистиллированной воды: пептон 10; дрожжевой экстракт 5, NaC1 10. Культивирование проводят при температуре 30 С с хорошей аэрао цией в течение 24 ч. 1 табл.

Штамм В. megaterium 361 характеризуется следующими признаками, Морфологические признаки: клетки неподвижны, грамположительные, палочковидные, соединены в длинные нити, в старой культуре возможны вздутые неправильные Йормы, палочковидные клетки с веретенообразными концами.

Размеры клеток 1,2-1 4х2,8-10,0 мкм.

Споры не превышают диаметр клетки, эллиптические, расположение разнообразное (центральное, эксцентральное, терминальное).

Культуральные и Йизиологические признаки.

1631080

Культивирование проводят при 30 С о с хорошей аэрацией в течение 24 ч. 45

Выход биомассы составляет 10,0 г на 1 л среды.

Выход рестриктазы составляет

1 млн.ед.акт, на 1 r биомассы.

Преимущества предлагаемого штамма

Bacillus megaterium 361 по сравнению с известным показаны в таблице.

Ф

: Как видно из таблицы В.megaterium менее. требователен к составу питательной среды, выход биомассы этого штамма с 1 л среды как минимум в 5 раз больше, чем выход биомассы В.sphaericus. Выход рестриктазы с 1 л культу—

Метаболизм дыхательный. Реакции на каталазу, амилазу, желатиназу, фенилаланиндегидролазу и Фогес-Проскауэра положительны. Штамм восстанавливает нитраты, не выделяет индол, растет на среде с добавлением 7, NaC1, выделяет кислоту и газ на глюкозе, растет при рН 5,7, параспоральные тельца не обнаруживаются, наблюдаются неокрашенные глобулы. Максимальо ная температура роста штамма 35-40 С, минимальная 3-20 С, рост при 50 С отсутствует. Тест на лецитиназу, тиразиназу — отрицателен, при 0,001 . 15 лизоцима не растет.

Штамм хранится в 15 -ном глицерине о в L-бульоне при минус 60 С и в лиофильно-высушенном состоянии.

На РПА (рыбопитательный агар) образует непрозрачные, белесые колонии,,блестящие, со временем шероховатые, край ровный. На РПБ рыбопитательный бульон образует .пленку, муть, осадок.

Продуцируемая предлагаемым штаммом рестриктаза характеризуется следующими свойствами.

Узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов ВЕССС; оптимальное значение рН дпя действия рестриктазы 7.,5-9,0; оптимальная температура действия 37оС; для активности рестриктазы требуются ионы Mg

+Ф с оптимальной концентрацией 5-10 мМ; оптимальная концентрация NaC1 0-50мИ.

Для культивирования В,megaterium

361 применяют питательную среду следующего состава, г/л дистиллированной воды:

Пептон 10

Дрожжев ой экстракт 5

NaC1 10 ры B.megaterium в 10 раз выше, чем

4 с 1 л культуры В.sphaericus„

Пример. Клетки В.megaterium

36 1, хранящиеся в 15Х-ном глицерине в Ь-бульоне при минус 6040, размораживают и высевают для оживления в L-бульон, инкубируют 24 ч при 30оС.

Полученную жидкую культуру высевают на чашки РПА для получения отдельных колоний, инкубируют 24 ч при 30 С.

Выращенную на плотной среде культуру проверяют на чистоту и засевают ею 50 мл L-бульона для получения инокулята, выращивают 18 ч при 30 С. о

Полученным инокулятом (ОП З,б) засевают колбы с 250 мл LB с 1Х глюкозы, выращивают 24 ч (ОП 3,8), После охлаждения клетки собирают центрифугированием. Выход биомассы 10 r сырого веса с 1 л среды.

0,5 г клеток суспендируют в 10 мл буфера 0,1 M трис-НС1, рН 8,0, содержащего 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1Х тритон Х-100, 1 мг/мл лизоцима, в течение 20 мин при 0 С. Затем суспензию озвучивают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют . центрифугированием при 18000 об/мин в течение 40 мин при 4 оС и надосадочную жидкость, содержащую 500000 ед. акт.рестриктазы, наносят на колонку (1х5 см) с фосфоцеллюлозой Р11 уравновешенной буфером .А (10 мМ калийфосфат, рН 7,4, 10 мМ 2-меркаптоэтанол). Затем колонку промывают 5 мл

:буфера А и сорбированные белки элю ируют градиентом концентрации NaCl от О до 1 M в буфере А, общий объем градиента 20 мп, Собирают фракции объемом 1 мл. Фракции, содержащие активность рестриктазы (обычно элюирующиеся при 0,5-0,75 M NaC1), объединяют, диализуют в течение 3 ч против 200 мл буфера А. Отдиализованную фракцию наносят на колонку (объемом 1 мл) с гидроксилапатитом, уравновешенным буфером А, промывают 2 мл буфера А. Сорбированные белки элюируют градиентом концентрации калийфосфата от 0,01 до 0,8 М. Общий объем градиента 10 мл, собирают фракции по 0,5 мл, анализируют каждую фракцию на содержание рестриктазы. Фракции, содержащие фермент, обычно элюирующиеся при концентрации соли 0,40,78 М,"собирают и диализуют против буфера А, содержащего 50Х- ный ггыцерин. Полученный препарат фермента

1080

Поскольку рестриктаза Bme 361 I имеет сайт узнавания СССС идентичный сайту узнаваний Вара ? и Ilae III, она может заменить фермент и во всех генноинженерных работах.

Штамм бактерий Baci11us megaterium BKIIII В-4723 - продуцент рестрик» тазы Вше 361 I. (F/л) и рестриктазы (ед.акт./л) состава питательной среды

Состав, среды, г/л

Выход фермента ед.акт./л культуры

Выход биомассы, г/л среды

В.mega- В.sphaeterium ricus

В.mega- В.sphaeriterium cus

Триптон "Difco

Дрожжевой экстракт "Difho"

NaC1

Глюкоза

16720000 1192000

2,5

5 17,6

10

Пелтон

Дрожжевой автолизат

NaC1

Глюкоза

5 100

10000000 954000

2,0

Составитель И. Чаплина

Редактор Л. Пчолинская Техред Л.Сердюкова Корректор Л. Пилипенко

Заказ 524 Тираж 362 . . Подписное

BHHH1IH Государственного комитета по изобретениям и открытиям прн ГЕНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент" ° г.ужгород, ул. Гагарина,101

5 163 ,(1 мл) имеет концентрацию 500000 ед. акт./мл. 3а единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК mara Я в течение

1 ч при 37 С. Ферментный препарат о хранится при минус 20 С. Из 0,5 г получают 500000 ед.акт. рестриктазы Bme 361

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой

Вше 361 Х, проводят гидролиз ДНК фага ф рестриктазами Bme 361,1 BspR, Нае III по отдельности, а также совместный гидролиз этими рестриктазами. Полное совпадение фрагментов, полученных при гндролизе рестриктазами

Bme 361 I u BspR I, Hae III порознь и совместно указывает на то, что рестриктаза Вше 361 I является изошизомером рестриктаз BspR I .и Hae III, узнает и расщепляет последовательность нуклеотидов GGCC.

Зависимость выхода биомассы

В.megaterium и В.sphaericus от

Полученный штамм обладает также следующими преимуществами по сравне --. нию с известным: штамм не патогенен

5 для человека не требователен к пиФ тательным средам, хорошо растет, обеспечивая высокий выход культуры с 1 л среды, в 5 раз больший, чем известный штамм; обеспечивает повышенный выход целевого продукта, составляющий 1000000 ед.акт./мл биомассы (в 2 раза больше, чем в известном). !

20 Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я