Способ получения реагента для диагностики фитопатогенных бактерий рsеudомоnаs syringae 1 - 9 серогрупп
Изобретение относится к сельскохозяйственной биологии, в частности к иммунохимическим методам экспресидентификации фитопатогенных бактерий PSEUDOMONAS SYRINGAE. Целью изобретения является повышение чувствительности реагента. Способ получения реагента для диагностики фитопатогенных бактерий PSEUDOMONAS SYRINGAE заключается в следующем. Иммунную поливалентную сыворотку к 1 - 9 серогруппам P. SYRINGAE готовят путем механического смешивания в равных объемах серогрупповых сывороток, полученных иммунизацией кроликов штаммами, принадлежащими к 1 - 9 серогруппе. Титр полученных антисывороток 1 : 25600 - 1:52200. Корпускулярную суспензию STAPHYLOCOCCUS AUREUS шт. COWAN - 1 готовят путем культивирования стафилококка на мясопептонном агаре при 37°С в течение 12 - 18 ч, отделения биомассы от среды, инактивации ее при 80°С 1 ч, отмывания и обработки 50%-ным раствором этанола в течение 30 мин при 37°С. Реагент готовят коньюгацией сыворотки с суспензией стафилококка при 37°С в течение 30 мин с последующей отмывкой неприсоединившихся к белку А баластных веществ. Соотношение сыворотки и суспензии при приготовлении реагента 1:5 - 1:20. Способ позволяет получить более чувствительный реагент к антигенам PSEUDOMONAS SYRINGAE 1 - 9 серогрупп. 6 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
flO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Ъ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4494777/13 (22) 21.07,88 (46) 23.07.91, Бюл, М 27 (71) Киевский государственный университет им. Т,Г,Шевченко и Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного (72) З.В.Чеусова. Н.Е.Вихоть, А.Е.Вершигора, Л.М.Яковлева, P.È.Ãâoçäÿê и Л.А.Михальский (53) 632.07(088,8) (56) Микробиологический журнал. 1979, N. 3, с.222-229. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАГЕНТА ДЛЯ
ДИАГНОСТИКИ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS SYRINGAE 1 — 9 СЕРО ГРУПП (57) Изобретение относится к сельскохозяйственной биологии, в частности к иммунохимическим методам экспрессидентификации фитопатогенных бактерий
Pseudomonas зуг!поае. Целью изобретения является повышение чувствительности реагента. Способ получения реагента для диагностики фитопатогенных бактерий
Изобретение относится к сельскохозяйственной биологии, в частности к иммунохимическим методам экспрессидентификации фитопатогенных бактерий
P.syrlngae, Цель изобретения — повышение чувствительности реагента.
Способ получения реагента для диагностики фитопатогенных бактерий
Pseudomonas syringae заключается в следующем.
„,50,, 1665307 А1 (5!)5 G 01 N 33/53, С 12 0 1/00
Pseudomonas syrlngae заключается в следующем, Иммунную поливалентную сыворотку к 1-9 серогруппам P. syrlngae готовят путем механического смешивания в равных объемах серогрупповых сывороток, полученных иммунизацией кроликов штаммами, принадлежащими к 1 — 9 серогруппе.
Титр полученных антисывороток 1;25600—
1:52200, Корпускулярную суспензию
Staphylococcus aureus шт. Cowan-1 готовят путем культивирования стафилококка на мясопептонном агаре при 37 С в течение 12—
18 ч, отделения биомассы от среды, инактивации ее при 80 С 1 ч, отмывания и обработки 50 -ным раствором этанола в течение 30 мин при 37ОС, Реагент готовят коньюгацией сыворотки с суспензией стафилококка при 37 С в течение 30 мин с последующей отмывкой не присоединившихся к белку А балластных веществ. Соотношение сыворотки и суспензии при приготовлении реагента 1:5 — 1;20. Способ позволяет получить более чувствительный реагент к антигенам Preudomonas syringae
1 — 9 серогрупп. 6 табл.
Иммунную поливалентную сыворотКу к
1 — 9 серогруппам P.syrlngae готовят путем механического смешивания в равных объемах серогрупповых сывороток, полученных иммунизацией кроликов штаммами, принадлежащими к 1-9 серогруппам по следующей схеме.
Кроликов иммунизируют взвесью живых бактериальных клеток в 0,15 М растворе хлорида натрия с нагрузкой 1-я инъекция — 500 млн кл./мл, 2-я инъекция—
1665307
1 млрд кл./мл, 3-я инъекция — 2 млрд кл./мл, 4-я инъекция — 3 млрд кл./мл.
Интервалы между иньекциями 5 дн. Забор крови через 11 — 13 дн, после инъекций, Титры полученных антисывороток 1;256001:52200.
Корпускуля рную суспензию
Staphylococcus aureus шт. Cowan-1 готовят путем культивирования стафилококка на мясопептонном агаре при 37 С в течение 12—
18 ч, отделения биомассы от среды, инактивации ее при 80 С 1 ч, отмывания и обработки 50 -ным раствором этанола в течение 30 мин при 37 С.
Конь.огацию сыворотки с суспензией
) о
1 проводят при 37 С в течение 30 мин с после дующей отмывкой не присоединившихся к белку А балластных веществ. Соотношение сыворотки и суспензии при приготовлении реагента 1:5 — 1;20. Обработка только нагреванием не обеспечивает необходимой активности и стабильности белок А содержащих клеток. О наличии активного белка А на стафилококковых клетках после различных процедур приготовления стафи1 лококковой суспензии судят по способности корпускул стафилококка аггл ютинировать эритроциты, сенсибилизированные иммуноглобулинами в реакции непрямой гемагглютинации, а также непосредственно в процессе определения антигенов
P.syrlngae. При постановке реакции непрямой гемагглютинации в ряд лунок микропланшет вносят последовательности разведения взвеси стафилококка (0,05 мл) и
0,05 мл эритроцитарного диагностикума, и редставля ющего собой тон изиро ванн ые эритроциты, обработанные кроличьей сывороткой (титр 1:12.800). Установлено, что максимальноее разведение стафилококковой суспензии, при котором наблюдается отчетливая агглютинация сенсибилизированных эритроцитов, 1 10 кл./мл. Для стафилокок5 ка, обработанного известным способом— формалином I 10 кл./мл, отсутствие активности для стафилококка, обработанного лишь нагреванием, при постановке реакции через 24 ч и более после приготовления стафилококковой суспензии.
Разрушение протеолитических ферментов, инактивация стафилококка, закрепление на его поверхности активного в иммунологическом отношении белка А происходит при нагревании при 80 С 1 ч в сочетании с обработкой 50 -ным раствором этанола. При более низкой, чем 80 С, температуре факторы патогенности стафилококка не инактивируются в течение 1 ч, при более высокой температуре наблюдается экстракция белка А, разрушение клеток, что естественно влияет на качество реагента.
16-18-часовая агаровая культура стафи5 лококка применяется в связи с тем, что, используя для получения биомассы жидкие питательные среды (МПБ и пептонно-дрожжевую среду), был получен меньший выход биомассы на одинаковый объем питатель10 ной среды. При сокращении времени культивирования до 12-14 ч значительно уменьшается выход биомассы, а при увеличении до 20 — 48 ч наблюдаются потери активного белка А, который, видимо, 15 подвергается действию протеолитических ферментов.
Staphylococcus aureus шт. Cowan-1 получен из Чехословацкой коллекции микроорганизмов, в клеточной стенке этого штамма
20 содержится большее количество клеточносвязанного белка А по сравнению со штаммом АТСС 12598.
Реагент не снижает свою активность при хранении при 4 С 2 мес, а его составная
25 часть — суспензия клеток стафилококка — до
5. Активность реагента сохраняется в течение 1 года при хранении при 4 С, а его составной части — суспензии клеток стафилококка — более 1 года, 30 Пример 1. Реагент для экспресс-индикации антигенов P. Syringae получают следующим путем: стабильную инактивированную и активную по белку А суспензию золотистого стафилакокка штамма Cowan-i
35 как составную часть реагента получают прогреванием 12-18-часовой агаровой культуры стафилококка, смытый физиологическим раствором; тепловой обработки при 80 С
1 ч, отмывают центрифугированием при 3
40 тыс. об/мин 15 мин, после чего обрабатывают осажденные и убитые клетки 50 -ным раствором этанола с целью стабилизации клеток и белка А. Обработку этанслом продолжают 30 мин при 37 С. За ем клетки
45 снова осаждают, отмывают физиологическим раствором, доводят концентрацию до
107 и хранят при 4 С с добавлением мертиолята или азида натрия более 1 года без потери активности, 50 Для сенсибилизации стафилококка антисывороткой к 10 -ной суспензии стафилококка вносят поливалентную сыворотку к
Pseudomonas syringae из расчета 0,1 мл сыворотки на 1 мл 10 (,-ной клеточной суспен55 зии стафилококка. После 30-минутного инкубирования при 37 С не связавшиеся с белком А иммуноглобулины удаляют путем центрифугирования при 3 тыс. об./мин
15 мин. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе до 1 — 57-ной концентра1665307 ции, Приготовленный таким образом реагент для экспресс-индикации антигенов
P.syrlngae хранится при 4 С в течение 1 года без потери активности.
Пример 2. Для экспресс-индикации 5 антигенов Р,syrlngae на обработанное этанолом стекло пипеткой наносят 0,025 мл (1 капля) реэгента для экспресс-индикации антигенов P.syrlngae и 0,05 мл (2 капли) суспенэии клеток исследуемых бактерий в кон- 10 центрации 1 10 кл/мл. Результат учитывают в течение 1 мин (табл.1). Как видно из табл.1, корпускулярные антигены исследованных штаммов представителей всех серогрупп вида P, syringae по класси- 15 фикационной схеме Пастушенко Л.Т., Симонович И.Д. взаимодействовали с реагентом для экспресс-индикации антигенов
P.surIngae, Антигены бактерий других видов и родов с полученным реагентом давали от- 20 рицательный результат, что говорит о высокой специфичности реагента в отношении антигенов P.syringae.
Пример 3. Влияние концентрации стафилококковой суспензии и ее соот- 25 ношение с антисывороткой, используемые при приготовлении реагента на чувствительность реакции реагента с антигенами P.syrlngae. Эти данные приведены в табл, 2 и 3. 30
Использование 15 -ной взвеси стэфилококка затрудняет учет реакции в результате высокой густоты суспензии при визуальной оценке наиболее четко реакция проявляется при использовании 10 -ной 35 суспензии стафилококка. Таким образом, 10 -ная суспензия стафилококка является оптимальной при визуальном учете.
Как видно из табл.3, оптимальным соотношением сыворотки и суспензии стэфило- 40 кокка является 1:10.
Пример 4. Сравнение активности реагента. полученного по известному способу (с применением формальдегида), с предложенным, Получение реэгента и по- 45 становка реакций агглютинации проводилась так, как было описано ранее. Для сравнения использовали стафилококковую суспензию, фиксированную раствором формальдегида 0,5 — 3 ч, отмытую и прогретую 50 при 80 С 1 ч, и приготовленную предложенным способом. При обработке микробной массы стафилококка формальдегидом положительная реакция наблюдалась при концентрации 1.10 кл/мл, оценивался на 2+ и 55 учет реакции проводилась через 40 — 50 мин после ее постановки, При меньших концентрациях антиген P.syrlngae не выявлялся. Та же биомасса, термообработанная и входящая затем в состав реагента, onpeqe ляла тот же антиген в концентрациях 1.10—
1 10 кл/мл в течение 30 с — 15 мин . реакция при этом оценивалась на 4+.
Пример 5. Сравнительные данные способов приготовления стафилококконой суспенэии и сорбции поливалентной сыворотки к P.syringae. Сорбционную емкость определяли как количество мг белка сыворотки, сорбировавшегося на клетках стафилококка, и выражали в процентах по отношению к концентрации белков сыворотки. Данные представлены в табл. 4-6.
Как видно иэ табл.4, чем меньше сроки культивирования Staphylococcus aureus шт, Cowan-1, тем большей сорбционной емкостью в отношении иммуноглобулинов поливалентной сыворотки к P.syrlngae обладают его клетки, Но культивировать стафилококк менее 12 ч нецелесообразно, так как значительно понижается ныход биомассы, это неудобно также методически. Целесообразно культивировать стафилококк с целью получения специфического реагента
12 — 18 ч, считая оптимальным время культивирования 14 — 16 ч.
Как видно из табл. 5, наибольшей сорбционной емкостью обладает стафилококк, прогретый при 80 С. Хотя сорбционная емкость такого стафилококка ниже по сравнению с сорбционной емкостью живой культуры, но работать с такой биомассой более безопасно, кроме того, можно хранить более длительное время без потери активности, так как инактивируются протеолитические ферменты.
Для более полной инактивации стафилококков, а также с целью увеличения срока сохранения активности в связи со стабилизацией клеток и закрепления на их поверхности белка А, прогретую биомассу дополнительно обрабатывали этанолом разной концентрации (табл.5).
Таким образом способ позволяет получить более чувствительный реагент к антигенам P.syringae 1-9 серогрупп.
Формула изобретения
Способ получения реагента для диагностики фитопатогенных бактерий
Pseudomonas syringae 1 — 9 серогрупп, включающий приготовление кроличьей поливалентной иммунной сыворотки к указанным бактериям, отл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью повышения чувствительности реагентэ, поливалентную сыворотку смешивают в соотношении 1:5-1:20 с 5-10 -ной агаровой суспензией Staphylococcus aureus
1665307
C0wan-l, инактивированной при 80 С в тече- 37 С, смесь инкубируют при 37 С в течение ние одного часа и обработанной 50 -ным 30 мин и отмывают неприсоединившиеся к раствором этанола в течение 30 мин при белку А балластные вещества.
Таблица
Индикация корпускулярных антигенов P. Syringae с помощью реагента для экспресс-индикации антигенов P. Syringae
Штамм Серо- Реэультат группа реакции
Внд
181
281
-1025 II
467
Р-55
4394 IV
7923 IV
948
2399
7842 VI
8299 VI
223
VII
VIII ++++
225
7595 IX
9048
P. gladioli pvallicola 89
P. aeruginosa
Е ° co I i
П р и м е ч а н и е . - отсутствие реакцни, ++++ положительная реакция на 4 плюса по общепринятой оценке.
P. Syringae
P. Syringa
P. Syringae
P. Syringae
P. Syringae
P. Syringae
P. Syrizgae
Р. Syringae
P. Sy ring ae
P. Яу аждае
P. Syringae
P. Syringae
P . .Syringae
P. Syringae
P. cichorii
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
1665307
Таблиц a 2
Записи>езсть чувствительности реекцин от концентрации стафилокохковой суспензин при приготовлении реагента
Концентрация стафилококковой йтемм
P. Syringa суспензии
1Х 5Z
10Х
15Х
Концентрация внтигена (кл/мл) 467
++++ ++++
++++ ++++
++++ ++++
++++ ++
++++ ++++
++++ ++++ +
К-1025
+++
+++t + +++
+t+
+++ +
181
+ ++++ +++ +
++++ +н+
281
7923
4394
++++ +
++++ f+f f ++б+ +ff f
++++
++++
++ и++ ++++
++++ ++++
++++ ++++
+++ " +
2846 н++ +++ ++
Таблица 3
Зависимость чувствительности реакции от соотношения сыворотки и стафил»кок>совой (1ОХ) суспензнн при приготовлении реагсит
Соотношение сыворотки и ствфилококковой суспензни
Штамм
P. Syringau
1:50
1:20
1:5
Концентрация антигена> кл./мл
10т 1 10з 1 104
1:10s
1 . 1Ов
467
+++
++++
++++
+ ++++
++++
+к++
К-1025
++++ +
+ ++++
181
++++
+ +++4
+++
281
+ б+++
7923
++++ ° ++4Л ++
+++
+++
4394
++++
+н+
+и+
++++
++ >
++++
2846
+f+
+++
Таблица 4
Определение сор бциоиной емкости 10Х-ной .суспензии зиник клеток Staphylococcus
aureus- шт. Cowan-Т в отношении поливалентной антисыворотки к P. Syringae
Сорбционная емкость, Х
Время культивирования, ч
84, 93
87,83
85, 15
12
77, 68
"76,52
75, 30
20
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++++
++н ++++
++++ ++++
+++ . н++
++++ +
++++
++++
++++
++tt
++++
+б++
1665307
Таблица 6
° Температура, С е
Концентрация этанола, у
Сорбционная емкость, орбционная емкость, Х
l0
30
57,77
61,65
50
66>02
65,53
60
Составитель Ю.Рогачев
Техред M.Ìîðãåèòàë Корректор И.Муска
Редактор В.Данко
Заказ 2389 Тираж 419 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101
Таблица 5
Определение сорбционной емкости
10I-ной ииактивированной в равнык температурных решимах суспенвии йтаоhvlоcоccuв auteua шт. Cowan-I в отношении поливалеитной антисыворотки к P.Syringae
57,77
58>74
73,30
65,53
Определение.сбрбциоиной емкости 102-ной инактивированной нагреванием и обраббтанной этанолом равной концентрации суспенэии Staphylococcus aureus шт, Cowan- 1 в отношении поливелентной антисыворотки к Р. Syringae
