Штамм бактерий jersinia реsтis - продуцент цамф- связываюшего белка

 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и необходимо для разработки методов тестирования представителей рода YERSINIA, конструирования бесклеточной системы, в опытах по "посадке" РНК-полимеразы на матрицу ДНК. Целью изобретения является создание штамма YERSINIA PESTIS, способного образовывать повышенное количество белка, связывающего циклический аденозин-3<SP POS="POST">1</SP>, 5<SP POS="POST">1</SP>-монофосфат. Штамм чумного микроба КМ 223 суа является производным вакционного штамма YERSINIA PESTISEV 76 линии НИИЭГ. ПОЛУЧЕН ПРИ ПОМОЩИ ХИМИЧЕСКОГО МУТАГЕНЕЗА N-МЕТИЛ-N-НИТРО-N-НИТРОЗОГУАНИДИНОМ КАК МАЛЬТОЗОНЕГАТИВНЫЙ МУТАНТ С ПОСЛЕДУЮЩИМ ТЕСТИРОВАНИЕМ АКТИВНОСТИ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ И ЦАМФ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО БЕЛКА ПО КИНЕТИКЕ НАКОПЛЕНИЯ НУКЛЕОТИДА. ВЫХОД ЦЕЛЕВОГО ПРОДУКТА СОСТАВЛЯЕТ 4 - 5% ОТ ОБЩЕГО БЕЛКА БИОМАССЫ, ПРИ АКТИВНОСТИ 1,35 МОЛЕЙ/МГ БЕЛКА. ШТАММ ДЕПОНИРОВАН ВО ВСЕСОЮЗНОМ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОМ ПРОТИВОЧУМНОМ ИНСТИТУТЕ "МИКРОБ".

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

PЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 1/21

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ы (21) 4732622/13 (22) 25.08.89 (46) 07.08.91. Бюл. М 29 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) В.Е.Валенцев и Л.А.Шевченко (53) 575.252,2(088.8) (54) ШТАММ БАКТЕРИИ JERSINIA PESTIS—

ПРОДУЦЕНТ ЦАМФ-СВЯЗЫВАЮЩЕГО

БЕЛ КА (57) Изобретение относится к медицинской микробиологии и необходимо для разработки методов тестирования представителей рода 3erslnla, конструирования бесклеточной системы. в опытах по "посадке" PHK-полимеразы на матрицу ДНК. Целью изобретения

Изобретение относится к медицинской микробиологии, необходимо для разработки методов тестирования представителей рода .Iersinla, конструирования бесклеточ ной системы, в опытах по "посадке" РНКполимеразы на матрицу ДНК с целью отбора высокоэффективных промоторов, в экспериментах генной инженерии и биохимии, Цель изобретения — получение штамма

Jerslnia pestls, способного образовывать повышенное количество белка, связывающего циклический аденозин-3,5 -монофосфат (цАМФ}.

Штамм чумного микроба является производным Jersinla pestls ЕЧ76 линии НИИЭГ и получен при помощи химического мутагенеза под действием N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидина и последующей се-.

ЫЛ > 1668386 А1 является создание штамма Jersinia pestis, способного образовывать повышенное количество белка, связывающего циклический аденозин-3, 5 -монофосфат. Штамм чум ного микроба KM 223 суа является производным вакционного штамма Jerslnla

pestisev 76 линии НИИЗГ, Получен при помощи химического мутагенеэа N-метилN-нитро-N-нитрозогуанидином как мальта. зонегативный мутант с последующим тестированием активности аденилатциклазы и цАМФ+связывающего белка по кинетике накопления нуклеотида. Выход целевого продукта составляет 4-5 от общего белка биомассы, при активности 1,35 моль/мг белка. Штамм депонирован во Всесоюзном научно-исследовательском противочумном институте "Микроб". лекции на индикаторных средах как Mal варианта с плейотропным характером мутаци- в онного повреждения. (, Ь

Штамм характеризуется следующими 0 признаками.

Культурально-морфологические свойства. Клетки штамма, окрашенные по Граму, имеют вид полиморфных грамотрицатель-, 00 ных неподвижных палочек овоидной фор-, 0 мы размером 0,5х1,0 мкм. В мазках иэ бульонных культур встречаются биполярно окрашенные клетки, расположенные короткими цепочками. На поверхности агара Хоттингера (рН 7,1) при 28 С через

48 ч инкубации культура штамма формирует колонии в P-форме с шероховатым центром и кружевной зоной, типичные для морфологии чумного микроба. В бульоне

Хоттингера (рН 7,1) при 28 С через 24 ч культивирования штамм дает придонный аг1668386 глютинативный рост в виде хлопьев, среда при этом остается прозрачной, Штамм Jersinla pestls KM 223 суа не патогенен.

Ф изиолого-биохимические свойства.

Штамм ауксотрофен и нуждается для размножения в L-фенилаланине и L-метионине.

Оптимальными условиями культивирования клеток штамма КМ 223 суа являются значения рН 7,1, t = 26 — 30 С. Клетки КМ 223 суа способны утилизировать в качестве источника неорганического азота NH-ионы, а также аминный азот в составе аминокислот, Штамм не способен ферментировать глюкозу, маннозу, фруктозу, манит, мальтоэу, галактозу в индикаторных средах Гисса и утилизировать эти углероды в качестве единственного источника углерода на поверхности минимальных питательных сред на основе среды M 9. Клетки штамма способны размножаться в интервале значений рН 6,6 — 8,5.

Особенностью штамма является способность продуцировать повышенное количество белка, связывающего циклический аденоэин-3,5 -монофосфат, и искусственно введенная в геном мутация, повреждающая активность фермента — аденилатциклазы (КФ 4.6,1.1).

Биотехнологические характеристики, Оптимальными условиями выращивания, штамма для получения продукта цАМФ-связывающего белка является агар Хоттингера с рН среды 7 1, температура 28 С, продолжительность культивирования бактериальной массы 48 ч. При этом выход продукта составляет около 4 — 5% от тотального белка . бактериальной массы, Активность аденилатциклазы определяют по способности синтезировать циклический аденоэин-3,5 -монофосфат.

Детектирование цАМФ проводят по методу, основанному на конкуренции между намеченным цАМФ и неизменным количеством

3-Н-меченного нуклеотида за связывание белка протеинкиназы, Штамм чумного микроба KM 223 суа хранится в музее живых культур Всесоюзного научно-исследовательского противочумного института "Микроб" под номером KM

223 суа, Пример 1. Бактериальную массу клеток выращивают на агаре Хоттингера при рН 7,1 в течение 48 ч при 28 С. Клетки суспендируют в 300 мкл 50 мМ трис-HCI (pH

7,5} с 4 мМ ЭДТА (буфер А) до концентрации

2 ЧО кл/мл, добавляют 100 мкл хлороформа и встряхивают в течение 15 — 20 мин. Полученный гомогенат центрифугируют при

10000 g и надосадочную жидкость исследу5

10 ют на содержание циклического АМФ- и цАМФ-связывающего белка. Количество белка в надосадочной жидкости определяют методом, основанным на спектрофотометрировании растворов при двух длинах волн., где мерой концентрации белка служит разность в величине оптической плотности (ОП) при 228,5 и 234,5 нм. Концентрация белка в надосадочной жидкости, вносимой в пробу для определения цАМФ, составляет

40 — 60 мкг.

При определении цАМФ инкубацию образцов проводят на ледяной бане в течение

2 ч. Отделение белок-связанного цАМФ от несвязанного нуклеотида осуществляют адсорбцией свободного нуклеотида на угле марки "НоритА", для чего в каждую пробу добавляют 100 мкл угольной суспензии (2,6% раствор угля, 2% раствор БСА в буфе20 ре "А") с последующим центрифугированием при 10000 g в течение 1 мин. Равные количества суспернатанта (200 мии)иэ аликвот помещают во флаконы и просчитывают на жидкостном сцинтилляционном счетчи25 ке, С помощью "слепой" пробы определяют уровень неспецифически сорбирующейся радиоактивности. Этот фон вычитают из значения радиоактивности в каждой пробе.

Кроме того, в каждом опыте всю процедуру

30 инкубации и последующие операции проводят с пробами, в которые вносят немеченный цАМФ (нулевые). Радиоактивность нулевых проб(С ) делят на радиоактивность в каждой пробе (Сх). Таким образом, для

35 каждой пробы получают значение Co/Cx. По этим значениям строят стандартную калибровочную кривую и определяют количество цАМФ в исследуемом образце. Концентрацию нуклеотида выражают в пикомолях на 1

40 мг белка, При выявлении цАМФ-связывающей активности инкубационная смесь обьемом

200 мкл содержит 50 мкл буфера А, 50 мкл

3-Н-цАМФ (20000 имп,/мин) и 100 мкл ис45 следуемого экстракта (100 — 200 мкг по белку). После 2-часовой экспозиции в ледяной бане к пробе добавляют 100 мкл угольной суспензии, центрифугируют при 10000 g

1 мин и аликвоту в 200 мкл переносят во

50 флакон для счета на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Активность выражают в пикомолях цАМФ, связываемого 1 мг белка за 2 ч инкубации. Активность цАМФсвязывающего белка штамма чумного мик55 роба KM 223, суа составляет 1,35 пмоль/мг белка, что в 2 раза превышает активность цАМФ-связывающего белка исходного штамма )егз!и!а pestis EV 76 линии НИИЭГ, составляющую 0,6 пмоль цАМФ/мг белка, 1668386

Формула изобретения Штамм бактерий 3ersinla pestls КМ

223 суа — продуцент цАМФ-связывающего белка.

Составитель Т. Забойкина

Техред M. Моргентал Корректор М. Максимишинец

Редактор Н. Яцола

Заказ 2626 Тираж ЗЯ Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Клетки штамма КМ 223 суа выращивают на агаре Хоттингера при рН 7,1 и 28 С в течение 48 ч, Бактериальную массу разрушают и экстрагируют 0,02 М калийфосфатным буфером рН 7,0 с 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ

2-меркаптоэтанола, 2 глицерина (буфер

"А"). Экстракт осветляют центрифугированием при 18000 g 30 мин и для освобождения от нуклеиновых кислот фильтруют на приборе "Amicon" через мембрану XM 300.

К фильтрату добавляют фенил метилсульфонилфлюорид до конечной концентрации

1 мМ с последующей инкубацией в течение

4 ч при 37 С, Для частичного удаления балластных белков 740 мг белка наносят на колонку (25 х 300 мм) с ДЕ-52, уравновешенную буфером "А", со скоростью 50 мл/ч, АМФ-связывающая активность на ионообменник не сорбируется, полученный элюат, содержащий около 200 мг белка, для полного освобождения от сопутствующих белков наносят на колонку (20 200 мм) с биогелем

НТР, предварительно уравновешенную 10 мМ калийфосфатным буфером с рН 6,6, 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 2% глицерина (буфер "Б"). Активные фракции элюируют линейным градиентом 10 — 500 мМ буфера "Б" со скоростью элюции 20 мл/ч

24 ч. цАМФ-связывающий белок элюируют при ионной силе буфера "Б" около 400 MM.

Выход продукта (цАМФ-связывающего белка) составляет 2,4 от общего, белка бактериальной массы родительского штамма и 5,0 от общего белка бактериальйой массы штамма КМ 223 суа. Гомогенность препаратов подтверждают электрофорезом в полиакриламидном геле и првципитацией в агарозном геле с коммерческой чумной агглютинирующей сывороткой.

Пример 3. Для получения антисыворотки к гомогенному цАМФ-связывающему белку проводят иммунизацию кроликов породы Шиншилла весом 2,5 кг. Для одной инъекции используют 40-60 мкг белка, растворенного в физиологическом растворе. Непосредственно перед иммунизацией белковый препарат тщательно перемешивают с полным адьювантом Фрейнда в соотношении 2:1 в обьеме 0,2 — 0,3 мл. Животных иммунизируют подкожно через каждые 7дн

5 втечение 2мес. Отобразовавшегося сгустка сыворотку отделяют центрифугированием при 3000 об./мин в течение 15 мин. Сыворотку хранят при — 20 С.

Моноспецифическую сыворотку к Crp10 белку чумного микроба используют для обнаружения сходного белка у других микроорганизмов. Для определения антигенного. родства в реакции преципитации берут очищенный препарат Crp-белка чум15 ного микроба (продукт), грубый экстракт микроба чумы и экстракты клеток Е,соП, J.entегоcolitica, J. pseudotuberculosis, Mlcrococcus lysodeictlcus, Vibrio NAG, Vibrio

eltor, Bacillus anthracis u Bordetefla

20 pertussis.

Нагрузка гомогенного Crp-белка составляет 6 мкг в лунку, а экстрактов 0,5 мг.

Образование линий преципитации наблюдают только в случае очищенного цАМФ25 связывающего белка, экстрактов чумного микроба и J..pseudotuberculosis. У остальных микроорганизмов, включая и таксономически близкую J.entегоcolltlca, данным методом сходного белка не обнару30 живают.

Штамм Jersinla pestis KM 223 суа отвечает всем требованиям культуры-продуцента — безопасный для окружающих при работе, обладает повышенным уровнем

35 продукции цАМФ-связывающего белка и несет мутационное повреждение гена аденилатциклазы.

Таким образом, изобретение позволяет получить гомогенный цАМФ-связывающий

40 белок с активностью до 1,35 пмоль/мг белка при выходе целевого продукта 4-5 от общего белка биомассы штамма.