Штамм ротавируса человека для получения иммунобиологических препаратов

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к разработке диагностических и лечебно-профилактических препаратов. Цель изобретения - получение высокорепродуктивного штамма ротавируса человека. Ротавирус человека Минск-86 характеризуется следующими свойствами: размер 65-70 нм, геном - двухцепочечная сегментированная (11 фрагментов) РНК. Вирус не обладает гемагглютипирующей активностью. Штамм Минск-86 характеризуется высокой репродуктивной способностью - титр 109-1010 ГЦДбо/мл. Штамм депонирован в Государственном центре патогенных микроорганизмов МЗ СССР (Вирусы), номер депонента ГКВ Ns 2172. 2 табл. Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ЕЩЯЮ3@

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4791474/13 (22) 19.12.89 (46) 30.10.91. Бюл. N 40 (71) Белорусский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (72) В,Г.Гудков, П.Г.Рытик, В.В.Шумко, А.С.Виринская, И.В,Неплюев и Ю.Г.Илькевич (53) 576.8,094.29 (088.8) (56) Букринская А.Г. и др. Морфологическая характеристика ротавирусов и структура их генома. — Вопр. вир., 1986, N. 2, 190 — 197, Васильева В.И. и др. Выделение ротави- руса человека на культуре клеток почек зеленых мартышек. — Вопр. вир,, 1986, hh 3, с.

360 — 362.

Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к разработке диагностических и лечебно-профилактических препаратов.

Цель изобретения — получение высокорепродуктивного штамма ротавируса человека (РВЧ).

Штамм депонирован в Государственном центре патогенных микроорганизмов

М3 СССР (Вирусы), номер депонента ГКВ

М 2172.

Характеристика штамма.

Название вируса штамма: ротавирус человека, штамм "Минск-86".

Место в универсальной системе: семейство ротавирусов, род ротавирусов, ротавирусы человека.. !Ж, 1687613 А1 (54) ШТАММ РОТАВИРУСА ЧЕЛОВЕКА

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ (57) Изобретение относится к медицинской вирусологии, в частности к разработке диагностических и лечебно-профилактических препаратов. Цель изобретения — получение высокорепродуктивного штамма ротавируса человека. Ротавирус человека

"Минск-86" характеризуется следующими свойствами: размер 65 — 70 нм, геном— двухцепочечная сегментированная (11 фрагментов) PHK. Вирус не обладает гемагглютинирующей активностью. Штамм

"Минск-86" характеризуется высокой репродуктивной способностью — титр 10 — 10

9 10 ,ГЦД50/мл, Штамм депонирован в Государственном центре патогенных микроорга.низмов МЗ СССР (Вирусы), номер депонента ГКВ N. 2172. 2 табл.

Штамм выделен из фекалий ребенка с диагнозом острой кишечной инфекции.

Физико-химические свойства: криптог- Ч рамма, размер 65 — 70 нм, PHK двухцепочеч- 0 ная. вй

Генетические признаки: геном, сегмен- . (Д тированный из 11 сегментов, так называемый "длинный" электрофоретип.

Прочие свойства: адаптирован в культуре клеток МА-104, вызывает ЦПЭ через 2 сут после инфицирования, не агглютинирует эритроциты морской свинки и человека.

Антигенные свойства. В тестах иммуноферментного анализа, встречного иммуноэлектроосмофо реза, иммуноэлектрон ной микроскопии отмечается специфическое взаимодействие с иммунными поликлональными сыворотками к штаммам Wa, SA" 11 ротавирусов; в иммуноберментном анализе в 4 и более раз активнее с гомологичной антисывороткой, чем штамм Wa с антисывороткой к штамму "Минск-86".

Эпидемический штамм ротавируса человека "Минск-86" адаптирован к перевиваемой культуре клеток МА-104, По своим свойствам ш гамм отличается от других штаммов: ротавируса человека Wa u обезьян SA-11, Штамм "Минск-86" характеризуется высокой репродукционной способностью (10 — 10 ) и может быть использован при разработке и производстве диагностических и лечебно-профилактических препаратов, Ниже приведены примеры, иллюстрирующие способ получения штамма "Минск86" и анализ его свойств, Пример 1. Выделение вируса, адаптация к культуре клеток MA-104.

Выделение вируса. Обработанную фреоном-113 10 -ную суспензию фекалий, приготовленную на растворе Хенкса, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин +4 С. С целью дополнительной очистки суспенэии ее центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин. Надосадочную жидкость переносят в стерильные флаконы и хранят при — 20 C. Наличие вируса в суспензии подтверждают методами ЭМ, ВИЭОВ (электронная микроскопия, встроечный иммуноосмоэлектрофорез).

Адаптация к культуре клеток МА-104, Пенициллиновые флаконы с перевиваемой

4-дневной культурой клеток МА-104 промывают солевым раствором Хенкса для удаления остатков сыворотки ростовой среды. На выросший слой клеток вносят по 0,2 мл 10 ной суспензии фекалий, обработанной смесью антибиотиков (100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина), а также трипсин (5 мкг/мл) и инкубируют в течение

30 мин. Флаконы центрифугируют в угловом роторе при 1000 об/мин 1 ч, Затем содержимое флаконов сливают и вносят по 1,0 мл поддерживающей среды (смесь равных объемов среды 199 и среды Игла с добавлением трипсина (2,5 мкгlмл). Флаконы помещают в роллерную установку и инкубируют при

37 С в течение 2 — 3 сут. О репродукции вируса судят по ЦПЭ (цитопатическому эффекту). Содержимое пенфлаконов 2-кратно замораживают-оттаивают (для разрушения клеток), полученные лизаты в дальнейшем используют для следующего пассажа в культуре клеток (по описанному методу), а также для определения титра вируса, По данным электронной микроскопии в полученных клеточных лизатах обнаруживают вирионы диаметром 65--70 нм с характерной для ротавирусов структурой. Проведенные расчеты показывают, что концентрация вирионов в кульгуральной среде достигает 101g/ìë, 5 Большинство вирусных частиц имеет не проницаемую для контрастирующего вещества сердцевину, однако у части из них оно заполняет центр вириона, свидетельствуя о принадлежности к так называемым "пус10 тым" неинфекционным частицам.

Пример 2. Определение титра вируса, Для определения титра вируса в полученной таким образом вируссодержащей

15 культуральной жидкости готовят ряд „г1есятикратных разведений от 10 до 10 (на

-1 растворе Хе н кса). Тит рован ие и ро водят на пенициллиновых флаконах с перевиваемой

4-дневной культурой клеток МА-104. Культи20 вирование проводят по схеме, изложенной в примере 1, использованной для адаптации вируса, за исключением того, что для заражения вносят по 0,1 мл каждого разведения вируса. Титр вируса определяют на 4 сут по

25 ЦПЭ.

В табл,1 приведены результаты титрования инфекционной активности штамма

"Минск-86" ротавируса человека, ТЦДо в 1 мл =- 9,96+0,18, 30 ТЦД 0 рассчитывают статистически по

Риду и Менчу в модификации Кербера. Расчеты выполняют по программе "WF".

Пример 3. Определение гемагглютинирующей способности вируса "Минск-86", 35

Реакция гемагглютинации РГА. Ставят реакцию с 0,5% эритроцитами морской свинки и О (1) группы крови человека на 0,5

М фосфатном буфере (ФСБ) по общеприня40 той методике, В качестве положительного контроля применяют штамм ротавируса обезьян (SA-11), сконцентрированный в 100 раэ. В сравнительных опытах со штаммами

"Минск-86" и SA-11 ротавируса обезьян ус45 тановлено, что в отличие от SA-11 выделенный штамм не вызывает агглютинации

0.5 -ной взвеси эритроцитов человека и морской свинки.

Пример 4. Изучение антигенных

50 свойств штамма РВЧ "Минск-86", а. Антигенные свойства штамма

"Минск-86" исследуют с помощью иммунной электронной микроскопии. Для проведения иммунной электронной микроскопии

55 готовят следующие разведения ряда иммунных сывороток: i /10. 1/50, 1/100, 1/1000.

Полученные разведения сывороток смешивают с вирусной суспензией в соотношении

i0;1 соответственно и оставляют на 1 ч при комнатнпй температ;ре. После этого прово1687613 дят негативное контрастирование образовавшихся иммунных комплексов. В качестве контрольной используют нормальную сыворотку морской свинки.

Иммунная микроскопия показывает, что иммунные сыворотки (как полученные на РВ SA-11, так и на штамм "Минск-86") в разведениях 1:50 — 1:1000 образовывают специфические иммунные комплексы (вероятно из-за наличия общих антигенных групп). Но иммунная сыворотка, взятая в качестве отрицательного контроля, специфического комплексообразования не дает со штаммом РВЧ "Минск-86". б, Антигенную активность штамма РВЧ

"Минск-86" изучают также методом встречного иммуноэлектроосмофореза (ВИЭОФ). С помощью ВЙЭОФ исследуют штамм, а также сыворотки морской свинки, иммунизированной этим штаммом. В качестве пол.ожительного контроля применяют;

1. Антиген — сконцентрированный в 100 раз рота вирус обезья í SA-11.

2. Антитела — сыворотки морских свинок, иммунизированных культуральным PB

АГ из штамма SA-11.

ВИЭОФ проводят на 1 -ном геле агарозы в веронал-мединаловом буферном растворе (рН 8,8, ионная сила 0,025).

ВИЭОФ между штаммом "Минск-86" и гомологичной cblBopoTKQA, а также сывороткой, полученной на вирус SA-11, дает четкие линии преципитации, специфичность которых подтверждается отсутствием таких преципитатов при взаимодействии неиммунных сывороток с вирусом и иммунных — c культурой клеток, на которой репродуцируется вирус. Титр сывороток в этой реакции составляет 1:64 — 1:128. в. Создание тест-системы для твердофазного иммуноферментного анализа на основе штамма рота вируса человека

"Минск-86", Основные компоненты системы: ротавирусный антиген, специфическая антиротавирусная сыворотка, иммуноглобулин, используемый для сенсибилизации твердой фазы, антиротавирусный пероксидазный конъюгат.

Ротавирусный антиген. Используют вируссодержащую взвесь на основе штамма

"Минск-86", адаптированного к культуре клеток МА-104.

Культуру клеток МА-104 выращивают роллерным способом в 0,5-литровых флаконах до образования полного монослоя. Вируссодержащую жидкость перед заражением обрабатывают трипсином в конечной концентрации 5 мкг/мл и инкубируют при комнатной температуре. Из флаконов сливают среду роста, а монослой трижды промывают раствором Хенкса, Вируссодержащую жидкость вносят s каждый флакон в разведении 10 — 10 по

-2 -3

5 10 мл и инкубируют в термостате 1 ч при

37 С в роллерной установке. Содержимое сливают и вносят по 50 мл поддерживающей среды (среда Игла и среда 199 в равном соотношении с добавлением 2,5 мкг/мл

10 трипсина, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,03 1-глютамина). Зараженную культуру инкубируют при 37 С в течение 48 ч до появления максимального цитопатического эффекта (поражение 90—

15 100 клеток), Флаконы подвергают 3-кратному замораживанию-оттаиванию для разрушения клеток. Обломки клеток удаляют низкоскоростным центрифугированием при 3000 и 6000 об/мин (по 30 мин), получен20 ную надосадочную жидкость используют для дальнейшей работы.

Специфическую антиротавирусную сыворотку получают путем гипериммунизации кроликов ротавирусным антигеном (табл.2).

25 Для иммунизации вируссодержащую суспензию концентрируют, добавляя 8 полиэтиленгликоля (М. 6000) и 0,15 M NaCI.

Инкубируют 18ч при 4"С, после чего центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин. Оса30 док ресуспензируют в 1/1000 объема исходного количества вируссодержащей сус пензии, В табл,2 приведена схема гипериммунизации, 35 Выделение антиротавирусного иммуноглобулина проводят осаждением риванолом и сульфатом аммония по общепринятым методикам.

Пример 5. Определение электрофо40 ретической подвижности фрагментов генома штамма РВЧ "Минск-86".

Выделение вирусной PHK. Для выделения нуклеиновых кислот (после удаления клеточного дебриса центрифугированием

45 при 8000 об/мин 10 мин) очищенную вирусную суспензию обрабатывают 1 -ным додецилсульфатом натрия в течение 10 мин при интенсивном перемешивании, Последующими экстракциями водонасыщенным

50 раствором фенола, хлороформом и эфиром проводят депротеинизацию, Полученный препарат PHK хранят при 4 С.

Электрофорез PНК в полиакриламид55 ном геле. Фрагменты РНК ротавирусов разделяют с помощью злектрофореза в 7,5—

10;Д-ном разделяющем полиакриламидном геле в прерывистой системе по Лемли при силе тока 10 мА в течение 16 ч. Гель окрашивают раствором серебра.

1687613

Электрофоретический анализ генома штамма "Минск-86" показывает, что он содержит 11 сегментов(двухцепочечной РНК), которые распределены по классам. Для определения типа миграции их сравнивают 5 со стандартной д4я рода РНК вируса И/а

I, которая характеризуется "длинным" электрофоретипом. По типу миграции двух последних сегментов РНК ротавирусов

"Минск-86" и Wa существенной разницы 10 не обнаружено, что позволяет отнести ротаФормула изобретения

Штамм ротавируса человека ГКВ ¹ 2172 для получения иммунобиологических препаратов.

Таблица 1

1роявление ЦПЭ в зар ло флаконов, взятых в ем 50 кл

Таблица 2 мер введения тигена

Составитель И. Тареева

Техред M,Mîðãåíòàë Корректор В, Гирняк

Редактор М. Петрова

Заказ 3678 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1 I3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Î

О

О

О

О

О

О вирус человека "Минск-86" к длинногеномным электрофоретипам.

Отмечается существенное различие в электрофоретической подвижности соответственно 3. 4, 6, 7 фрагментов штаммов

"Минск-86" и WA I,