Способ определения жизнеспособности эмбрионов лабораторных мышей

 

Изобретение относится к способам определения физиологического состояния биологических объектов и может быть применено в биотехнологии, животноводчестве, эмбриологии. Цель изобретения - повышение чувствительности и ускорение 2 способа. Цель достигается тем, что эмбрионы лабораторных мышей и маркер-сефадексовую гранулу G-100 fine помещают на стартовую позицию в камере для электрофореза , заполненной питательной средой, состоящей из глюкозы концентрации 4,9- 5,1% и раствора Дульбекко-Фогт с кондуктивностью 20-30/гЗ. Через камеру пропускают электрический ток с градиентом потенциала 5-15 В/см и регистрируют под микроскопом в потоке электроосмоса вектор и величину скорости эмбрионов по отношению к таковым маркера. Полученную величину скорости эмбрионов подставляют в формулу, связывающую скорость эмбрионов (V) с их жизнеспособностью (Р), и получают % выживаемости у протестированной группы эмбрионов Р, % 10,337+ 18,970 V-1.107- V2.1 табл. 10

сок)з совет ских

COilИАЛИСТИЧЕCKИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТБЕННЦИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЬ ТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ И С)БРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4711505/13 (22) 30.06.89 (46) 07.11.91. Бюл. № 41 (71) МГУ им. M. В. Ломоносова (72) А, А, Языков и Г. Ф. Калантаров (53) 591.3(088.8) (561 Brlnster R. L. А method for in vitro

cultivation of mouse ova from two-cell to

blastocyst.— Ехр. Cell. Res. 1963, v.32, ¹1, р. 205-208. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ ЭМБРИОНОВ ЛАБОРАТОРHblX МЫШЕЙ (57) Изобретение относится к способам определения физиологического состояния биологических объектов и может быть применено в биотехнологии, животноводчестве, эмбриологии, Цель изобретения — повышение чувствительности и ускорение

Изобретение относится к способам определения физиологического состояния биологических объектов и может быть применено вбиотехнологии,,животноводстве, эмбриологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности и ускорение способа, Способ осуществляется следующим образом.

Берут морфологически одинаковые нормальные эмбрионы мышей в их естественной целостности, помещают в среду следующего состава: глюкоза 4,9 — 5,1 мас.,ь. остальное — деионизованная вода с кондуктивностью, доведенной до 20 — 30,и S сбалансированным солевым раствором

„„ЫХ„„1б88848 А1

5,1, и раствора Дульбекко-Фогт с кондуктивностью 20 — 30,и S. Через камеру пропускают электрический ток с градиентом потенциала 5 — 15 В/см и регистрируют под микроскопом в потоке электроосмоса вектор и величину скорости эмбрионов по отношению к таковым маркера, Полученную величину скорости эмбрионов подставляют в формулу, связывающую скорость эмбрионов (V) с их жизнеспособностью (P), и получают o выживаемости у протестированной группы эмбрионов

Р, = 10,337+ 18,970 ° V— - 1,107 ° Ч . 1 табл.

Дульбекко-Фогт, взятым в необходимых для данной кондуктивности количествах. Pac- CO твор Дульбекко-Фогт, мас.,: NaCI 0,8; KCI OO

0,02; CaClz 0,01; MgClz ° 6НгО 0,01; КНгР04 .фЪ.

0,02; NagHP04 ° Н20 1,42: вода деионизо- QQ ванная — остальное, рН 6,8. Через среду с эмбрионами в камере для электрофореза с неполя ризующимися Ад/Ag CI электродами пропускают электрический ток с градиентом потенциала 5 — 15 В/см и регистрируют скорость движения эмбриона в потоке электроосмоса на дне камеры. О жизнеспособности судят, сравнивая скорость и вектор движения эмбриона с тактовыми маркера, в качестве которого берут полимерную сферическую гранулу сефадекса 5 — 100 fine, которая по своим параметрам близка к параметрам эмбриона и (например, эмбриона мыши) и, как эмбрион, имеет отрицательную плавучесть, форму и размеры, аналогичные эмбриону, а в отличие от эмбриона имеет электрически нейтральную поверхность и способность двигаться в электрическом поле в строгом соответствии с вектором и скоростью потока электроосмо-. са.

Для определения жизнеспособности эмбрионов мышей предлагается эмпирическая формула, отражающая зависимость между скоростью движения эмбрионов и их жизнеспособностью:

Р, %=10,337 +18,970 V — 1,107 ° Ч, (1) где P — величина жизнеспособности эмбрионов, указывающая процент выживаемости у эмбрионов, имеющих данную скорость;

V — скорость в потоке электроосмоса у тестированного эмбриона с учетом скорости и вектора движения маркера, (мкм/с)/ тотальности эмбрионов, что неприемлемо при определении их жизнеспособности.

Пример 2. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от беспородных белых мышей

SHK на стадии двух бластомеров в количестве 10 штук. Помещают их с маркером— сефадексовой гранулой диаметром 80 мкм, подобранным под средний размер эмбрионов, на одинаковую стартовую позицию на

10 дне злектрофоретической камеры со средой, состоящей из 5,0 мас.% г лnю кKо0з3ы, остальное — деионизованная вода с

Дул ьбекко-Фогт, пропускают электрический ток с градиентом потенциала 2 В/см, наблюдают движение маркера к катоду и начало проявления собственной электрокинетической подвижности к аноду у некоторых эмбрионов с сохранением исходных морфологических признаков у всех эмбрио20 кондуктивностью, доведеннои до 25,и S

15 сбалансированным солевым раствором (В/см);

* — коэффициенты, подобранные 3ВМ на основе прямого анализа связи жизнеспособности с величиной скорости у тотальных эмбрионов, принятых в качестве стандарта.

Пример. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от беспородных мышей SHK на стадии двух бластомеров в количестве 10 штук. Помещают их с маркером — сефадексовой гранулой G — 100 fine, диаметром 80 мкм, подобранным под средний диаметр эмбрионов, на одинаковую стартовую позицию на дно электрофоретической камеры со средой, состоящей из 5,0 мас,% глюкозы, остальное — детонизованная вода с кондуктивностью, доведенной непосредственно по кондуктомеру до 10,и S сбалансированным солевым раствором Дульбекко-Фогт, взятым в необходимом для данной кондуктивности количестве, пропускают электрический ток с градиентом потенциала 2В/см (измеряемым непосредственно в камере с помощью серебряных электродов) в течение 1 мин, наблюдают движение маркера к катоду и отсутствие собственной электрокинетической подвижности эмбрионов, Повышают градиент потенциала до

10 В/см, наблюдают движение маркера и отсутствие собственной электрокинетической подвижности эмбрионов, Повышают градиент потенциала до 20

В/см, наблюдаютдвижение маркера к катоду и проявление собственной электрокинетической подвижности — у 60% эмбрионов к аноду, однако 40% эмбрионов за время измерения теряют исходные морфологические признаки, т, е. г1роисходит нарушение

50 нов.

Делают заключение, что данное сочетание числовых значений параметров обладает недостаточной разрешающей способностью, так как электрокинетическую подвижность проявляют только некоторые единичные эмбрионы, Повышают градиент потенциала до 10

В/см, наблюдают движение маркера к катоду и проявление собственной электрокинетической подвижности у 80 % эмбрионов к аноду при сохранении исходных морфологических признаков у 100% эмбрионов. Делают вывод о том, что данное сочетание числовых величин является приемлемым, так как у всех эмбрионов не утрачиваются исходные морфологические признаки, и они проявляют активную собственную электрокинетическую подвижность, Далее повышают градиент потенциала до 20 В/см, наблюдают движение маркера к катоду и проявление собственной электрокинетической подвижности у 90% эмбрионов к аноду, однако у 50% эмбрионов утрачиваются исходные морфологические признаки, т. е. происходит нарушение тотальности эмбрионов, что неприемлемо при определении их жизнеспособности, Пример 3. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от беспородных мышей SHK на стадии двух бластомеров в количестве 9 штук, Помещают их с маркером — сефадексовой гранулой диаметром 80 мкм (подобранной в соответствии с диаметром тестируемых эмбрионов) на одинаковую стартовую позицию на дне электрофоретической камеры со средой, состоящей из 5,0

1688848

50

55 мас. глюкозы, остальное †деионизованн вода с кондуктивностью, доведенной по кондуктометру до 50,и S сбалансированным солевым раствором Дульбекко-Фогт, пропускают. электрический ток с градиентом потенциала 2 В/см, наблюдают движение маркера к катоду и начало проявления электрокинетической подвижности к аноду у некоторых эмбрионов без изменения исходных морфологических признаков у всех эмбрионов. Повышают градиент потенциала до 10 В/см, наблюдают движение маркера к катоду и проявление собственной электрокинетической подвижности у 77,8 эмбрионов к аноду, однако 44,5 эмбрионов в процессе измерения теряют исходные морфологические признаки, т. е. происходит нарушение тотальности эмбрионов, что неприемлемо при определении их жизнеспособности.

Пример 4. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от беспородных мышей SHK u линейных мышей C57Bf/6J на стадии двух бластомеров в количестве 10 штук в случайном сочетании, Помещают поочередно их и маркер — сефадексовую гранулу диаметром

80 мкм на одинаковую стартовую позицию на дне электрофоретической камеры со средой, состоящей из 4,8 мас. глюкозы, остальное — деионизованная вода, с кондуктивностью, доведенной до 10,и S сбалансированным солевым раствором

Дульбекко-©огт, взятым в необходимом для данной кондуктивности количестве, пропускают электрический ток с градиентом потенциала 2 В/см в течение 1 мин.

Наблюдают в микроскоп отсутствие собственной электрокинетической подвижности у всех эмбрионов и пассивный.их перенос потоком электроосмоса в сторону катода со скоростью и вектором маркера. Вычисление собственной электрокинетической скорости эмбрионов невозможно.

Пример 5. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от беспородных мышей $НК и линейных мышей С57ВУ6) на стадии двух бластомеров в количестве 10 штук в случайном сочетании. Помещают поочередно их и маркер — сефадексовую гранулу диаметром

80 мкм на одинаковую стартовую позицию на дне электрофоретической камеры со средой, состоящей из 5,2 мас. г л ю к оoз ы, остальное — деионизованная вода с кондуктивностью, доведенной до 35 /с$ сбалансированным солевым раствором

Дульбекко-Фогг, взятым в необходимомдля данной кондуктивности количестве, пропу5

40 скают электрический ток с градиентом потенциала 20 В/см в течение 1 мин, наблюдают проявление электрокинетической подвижности у эмбрионов, однако 50% из них за время измерения их скорости теряют исходные морфологические признаки, т, е. происходит нарушение тотальности эмбрионов, что неприемлемо при определении их жизнеспособности.

Пример 6. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с блестящей оболочкой от беспородных мышей SHK на стадии двух бластомеров в количестве 12 штук, Помещают их поочередно с маркером — сефадексовой гранулой 6 — 100 йпе диаметром 80 мкм (т. е, равным среднему диаметру эмбрионов) на одинаковую позицию на дне электрофоретической камеры со средой, состоящей иэ 4,9 мас. глюкозы, остальное — деионизованная вода с кондуктивностью, доведенной до 20 p S сбалансированным солевым раствором

Дульбекко-Фогт, взятым в необходимом для данной-кондуктивности количестве, пропускают постоянный электрический ток с градиентом потенциала 5 В/см (измеряемым непосредственно в камере с помощью серебряных электродов) в течение 0,6 мин, как времени, достаточного для одновременного перемещения эмбриона и маркера на расстояние в несколько собственных диаметров, и по окулярмикрометру микроскопа отмечают вектор и измеряют путь, пройденные за это время эмбрионов и маркером, На основе этого вычисляют величину скорости эмбриона по отношению к маркеру и получают: 5 эмбрионов имеют среднюю скорость 2 +0,3 (мкм/c)/(B/ñì), подставляют среднее значение их скорости в формулу (1),. получают ожидаемую выживаемость

43,85 ; 7 эмбрионов имеют среднюю скорость 4,5 +1,1 (мкм/с)/(В/см), подставляют среднее значение их скорости в формулу(1), получают ожидаемую выживаемость

73,29 .

Проверяют жизнеспособность данных групп эмбрионов раздельным культивированием в стандартных условиях (по методу

Виттена) в течение 74 ч, получают развитие до стадии бластоцисты соответственно 40 и

71,4 .

Пример 7. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от беспородных мышей SHK u линейных мышей C578f/6j на стадии двух бластомеров в количестве 42 штук в случай-. ном сочетании. Помещают поочередно их и маркер — сефадексовую гранулу диаметром

80 мкм на одинаковую стартовую позицию

1688848 на дне электрофоретической камеры со средой, состоящей иэ 5 0 мас. глюкозы, остальное — деиониэованная вода с кондуктивностью, доведенной до 25,и S сбалансированным солевым раствором

Дульбекко-Фогт, взятым в необходимом для данной кондуктивности. количестве, пропускают постоянный электрический ток с градиентом потенциала 10 В/см в течение 0,8 мин, как времени, достаточного для одновременного перемещения эмбриона и маркера на расстояние в несколько собственных диаметров, и по окулярмикрометру микроскопа отмечают вектор и измеряют путь, пройденный за это время эмбрионом и маркером, вычисляют величину скорости эмбриона по отношению к маркеру и получают: 22 эмбриона имеют среднюю скорость 9 +.1,5 (мкм/с)I(В!см), подставляют среднее значение скорости в формулу (1), получают ожидаемую величину выживаемости 90,9%; 15 эмбрионов имеют среднюю скорость 5,5 +. 1,9 (мкм/с)l(В/см), подставляют среднее значение скорости в формулу (1), получают ожидаемую выживаемость 81,19%; 5 эмбрионов имеют среднюю

3 0,7 (мкм/с)/(В/см), подставляют среднее значение скорости в формулу(1), получают ожидаемую выживаемость 57,28, Проверяют жизнеспособность данных групп эмбрионов раздельным культивированием в стандартных условиях в течение

74 ч, получают развитие в культуре соответственно 90,9; 73,3 и 60, Пример 8. Берут группу морфологически идентичных нормальных эмбрионов с оболочкой от линейных мышей С57В(/6J на стадии двух бластомеров в количестве 12 штук. Помещают их поочередно с маркером — сефадексовой гранулой диаметром 80 мкм на одинаковую стартовую позицию на дне электрофоретической камеры со средой, состоящей из 5,1 мас, глюкозы, остальное— деионизованная вода с кондуктивностью, доведенной до 30 /c S сбалансированным солевым раствором Дульбекко-Фогт, взятым в необходимом для данной кондуктивности количестве, пропускают постоянный электрический ток с градиентом потенциала

15 В/см в течение 1 мин, как времени, достаточного для одновременного перемещения эмбриона и маркера на расстояние в

10 собности, 25 Способ позволяет снизить время íà определение жизнеспособности эмбрионов

50 несколько собственных диаметров, и по окулярмикрометру микроскопа отмечают вектор и измеряют путь, пройденный эа это время эмбрионом и маркером, вычисляют величину скорости эмбриона по отношению к маркеру, получают среднюю скорость для

12 эмбрионов, равную 6,5 1,5 (мкмlс)/(В !см), подставляют среднее значение скорости из формулы (1), получают ожидаемую выживаемость 86,87%, проверяют жизнеспособность данной группы эмбрионов культивированием в стандартных условиях в течение 74 ч, получают развитие до стадии бластоцисты 91,67%.

В таблице приведены данные о влиянии концентрации глюкозы в питательной среде на изменение исходных морфологических признаков эмбриона.

Таким образом, понижение концентрации глюкозы ниже 4,9% и повышение сверх

5,1% приводит к изменению исходных морфологических признаков эмбрионов, что не приемлемо при определении их жизнесподо 0,6 — 1 мин и прогнозировать выживаемость эмбрионов до культивирования.

Формула изобретения.

Способ определения жизнеспособности эмбрионов лабораторных мышей по физиологическому параметру, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, в качестве физиологического параметра используют электрокинетическую подвижность эмбрионов и свойства маркера — сефадексовой гранулы в среде следующего состава: глюкоза

4,9 — 5,1 мас.%, деионизированная вода, кондуктивность которой доведена до 2030 p S сбалансированным солевым раствором Дульбекко-Фогт 100 мл, а жизнеспособность эмбрионов определяют по формуле

Р, %= 10,337-18,970 Ч вЂ” 1,107 V, где Р— величина, указывающая процент выживаемости у эмбрионов, имеющих данную скорость;

Ч вЂ” скорость в потоке электроосмоса у тестированного эмбриона с учетом скорости и вектора движения маркера, (мкм/с)/(В /см).

1688848

П р и м е ч а н и е. "+" — изменение исходных морфологических признаков

Составитель M. Малярова

Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор C. Черни

Редактор И. Шманова

Производственно-издательский комбинат патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 3760 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская.наб., 4/5