Способ прогнозирования эмбиотропной активности производных бензимидазола

 

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии. Цель - сокращение срока определения. С той; целью исследуют клетки красного костного мозга, определяют число метафг з и митотический индекс через 3-4 ч после введения исследуемого вещестга. В случае, если указанные показатели увеличиваются по сравнению с контролем на 10% и более, определяют эмбутютропную активность исследуемого препарата . Применение способа позтзоляет сократить срок определения эмбрнотроп-. ной активности производных бензимндазола с 1,5 месяцев до 2-3 дней по сравнению с прототипом.

„„80„„17О7545

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

С 01 Н 33/80, 1/28

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOt4Y СВИДЕТЕЛЬСТВУ

f

I !

s

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЬП ИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

1 (21) 4762559/14 (22) 27.11.89(46) 23.01.92. Бюл. У 3 (71) Всесоюзный научно-исследователь- ский институт гельминтологии им. К. И. Скря бин а (72) С.И.Чукина, Т.С.Новик и С.E.Ëàïòåâà (53) 615.475(088.8) (54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ЭИБРИОТРОПНОЙ ЛКТИВНОСТИ ПРОИЗВОД1ЫХ БЕНЗИМЩАЗОЛЛ г (57) Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии. Цель — со<

Изобретение относится к медицине, а именно к токсикологии.

Цель изобретения — сокращение сроков определения.

Способ осуществляют следующим образом.

Небеременной беспородной или линейной крысе (Вистар, ВАГ, Август . и т.п.) вводят испытуемый препарат из группы бензимидаэолов в 3 раза увеличенной терапевтической дозе в ви-. де суспензии с добавлением нескольких капель Твина-80 в качестве змульгатора. Суспензию вводят перорально через желудочный зонд. Три крысы препаратов не получают и служат контролем. Через 3-4 ч после введения испытуемого соединения -. пыт1ых и кон1рольнь1х крыс убива от деI

В -случае, если указанные показатели увеличиваются по сравнению с кон 1р. лем на 10К и более, определяют змб111отропную активность исследуемого препарата. Применение способа позволяет сократить срок опредсления змбриотро11-. нои активности производных бснзимидазола с 1,5 месяцев до ?-3 дней по сравнению с прототипом. ется интервал, то кости заворачивают

f в мокрую марлю. Костный мозг быстро вьмывают в центриАужную .пробирку с

3 мл гипотонического раствора хлорис- того калия (0,5557). Центрифу1н1ые про- . бирки с гипотоническим раствором о, предварительно подогревают до 37 С.

Пробирки с костным мозгом помещают о в термостат при 37 С на 6-9 мин. Затем центрифугируют при 1000 об/мин с (не больще) в течение 5 мин. Надосадоч. ную жидкость сливают и к осадку добавляют 1 мл св ежепри гот овле ни о го фиксатора (3 части метанола и 1 часть ледянрй уксусной кислоты) и оставляют на

1-? мин. Фиксатор сливалт., добавляют

1-2 мд свежей порции фиксатора и оставляют на 7 мин, затем фиксатор снова сг;1ва:ст, осалок остсро:.ло разбивают постук1пза!.!!eм паль1!a о пpnб;1"„::y ",о— бавляют 0,5 мл фиксатора и ставят в холодильник на 30 мин.

1707541

У

la чистые влажные охлажденные стекла раскапывают полученные сусиенэии клеток, сушэт над пламенем горелки.

Препараты окрашивают азур-эоэином (10X-ный водньп(растер).

Иа каждое химическое соединение готовят по 10 стекол: аналогично 10 сте.кол готовят и для контрольных крыс.

Под световым микроскопом (х20) подсчи-10 тывают число клеток, находящихся на

1стадиях про-, ана-, мета- и телофазы . и в интерфазе, в 10 полях зрения на каждоМ стекле. Подсчитывают общее число делящихся и интерфазных клеток, определяют процентное содержание клеток, находящихся на различных стадиях митоэа:

Определяют митотический индекс.

В случае, если эти показатели уве- 20 личиваются по. сравнению с контролем на 10Х и более определяют эмбриотропную активность исследуемого препарата.

Пример (. Трем белыч беспороднъж небеременным крысам массой 2?0240 r перорально через желудочнья зонд вводят оксфендазол в дозе 30 мг/л (в 3 раза повышенная терапевтическая доза) в виде водной суспензии с добавлением в качестве эмуль атора Твина-80. Три крысы препарата не получают и служат контролем. Через 3 ч после введения препарата опытных и контрольных животных одновременно убивают.

Из обеих задних конечностей извлекают

15 большие берцовь|е кости и заворачивают их в кусочки мскрой марли. Костный мозг, вьмывают в центрифужную пробирку с 3 мл гипотоническогэ раствора хлористого. калия (0,555Х), центрифу 1ые 40 пробирки предварительно подогревают до 37 С. Пробирки с кос-.ным мозгом о помещают в термостат при 37 С на 6,9 мин, затем центрифугпруют при

1000 об/мин, в течение 5 мин. Надоса- 45 дочную жидкость сливают, к осадку добавляют 1 мл свежеприготовленного фиксатора (3 части метанола и 1 часть ледяной уксусной кислоты), оставляют на 1-2 мин. Фиксатор с. †.ивают и добав. ляют 1-2 мл новой порции фиксатора, оставляют на 7 мни, затем вновь сливают. Осадок осторожно разбивают постукиванием пальца о пробирку, добавляют 0 5 мл фин=а-. орз и ставят и У 1 С

В xolIop,ильннк на 5 ; мцн.

Полученную суспензию клеток раска-. пывают на чистые, влажные и охлажденные стекла, сушат над пламенем горел- . ки. Препараты окрашнвэют аз р«эознном (10X-ныл! водный раствор), Описанньм способом готовят 10 стекол с суспенэией клеток от крыс, которым ввели оксфендазол, и 10 — от контрольных животных.

Под световым микроскопом (х20) в 10 полях зрения на каждом стекле подсчитывают число клеток, находящихся на стадиях про-, ана-, мета- и телофазы и в интерфазе. Подсчитывают общее число делящихся и интерфазных . клеток, определяют процентное содержание клеток, находящихся на различных стадиях митоза.и митотический индекс. . Пяти другим белым беспородным крысам массой 220-240 r на 9-й и 13-Й дни беременности вводят оксфендазол в дозе 30 мг/кг в виде водной суспензии с добавлением Твина-80 в качестве эмульгатора через рот с помощью желудочного зонда. Предварительный . отбор беременных самок проводят следующим образом: к самкам, находящимся в стадии экструса и проэуструса, вечером подсаживали самцов в соотношении 4:1, наутро просматривали влагалищные мазки, при обнаружении в них сперматозоидов считали первъи днем беременности.

Результаты учитывают на 20-й день беременности. Самок убивают декапитацией, вскрывают брюшную полость и матку. Подсчитывают число..желтых тел беременности в обоих яичниках, мест имплантации, число живых, мертвых и резорбированных плодов. Эмбрионы тщательно осматривают, регистрируя наружные аномалии, взвешивают и измеряют краниокаудальные размеры. Определяют пред-, постэмбриональн ла гибель, а также общую эмбриональную смертность плодов.

Статистическую обработку полученных данных проводят по тесту Стьюдента.

В результате оценки оксфендазола на антимитотическое действие установили; что при его введении белым.беспородным крысам в дозе 30 мг/кг процентное содержание про-, мета-, анан телофаз соответственно равнялось

8,59+2,74, 72,134.4,48, 11,47 .3,18, 8,19+2,74Х против аналогичных контро —,жк значешгt 5, 55+?, "-Я, 75,0 - +

«>4,33, 12,50+3,30 и 6,94+2,54Х. Значение митотического индекса в популяции

1701545

5 соматических клеток красного костного мозга опытных крыс через 3 часа после введения оксфендазола равнялось 1,73 1,30 против 1,6М1,25 в контроле, то есть не превышает 10%.

При введении этого же препарата беременным крысам-самкам на 9-й день эмбриогенеза уродливые плоды отсутствовали. Показатели эмбрибтоксического эффекта равнялись: предимплантационная rv.áåëü 7,81+ 3,38; постимплантационная гибель — 6, 78+2, 60; общая эмбриональная смертность — 14,06+

« 4, 38 против соответствующих контрольных значений: 4,11+2, 34, 10,00+

«3,59 и 13,69+4,05%. Масса и размеры плодов от опытных самок равнялись

2,18+0,04 и 2,85+,02 против контрольных значений 2,24+0,03 г и ?,83+ «+0,02 см.

Таким образом, из приведенных выше данных совершенно очевидно, что оксфендазол не обладает антимитотическим действием для популяции соматичес 25 ких клеток красного костного мозга самок и не оказывает отрицательного влияния на эмбриональное развитие крыс

Иежду двумя этими активностями имеется полная корреляция, 30

П р и и е р .".. Трем белым беспородным небеременнг,гм крысам массой 270240 r перорально через желудочный зонд вводят албендазол в дозе 20 мг/кг (в 3 раза повышенная терапевтическая доза) в виде водной суспензии с добавлением в <ачестве эмульгатора Тви- на-80. Три крысы препарата не получали и служили контролем, Через 4 ч после введения опытных и контрольных 40 животных одновременно убивают.Из обеих задних конечностей извлекают большие берцовые кости и заворачивают их в .кусочки мокрой марли. Костный мозг вымывают в центрифужную пробирку с 45

3 мл гипотонического раствора хлористого калия (8,555%), центрифужные пробирки предварительно подогревают до 37 С. Пробирки с костным мозгом о помещают в термостат при 37 С на 69 мин, затем центрифугируют при

1000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 1 мл свежеприготовленного фиксатора (3 част.". метанола и 1 часть ледяной уксусногг кислоты), остап..я:от на 1-2 мин. Фиксатор сливают и добавляют 1-2 мл новой порции фиксатора, оставляют на 7 мин, затем вновь сливают."Осадок осторожно разбивают по-:: стукиванием пальца о пробирку, добавляют 0,5 мл фиксатора и ставят я нов лодильник на ЗО мин.

Полученную суспензию клеток раскапывают на чистые, влажгп,ге и охлажденные стекла, сушат над пламенем горелки. Препараты окрашивают аэур-эозином (10%-ный водный раствор).

Описанным способом готовят 10 стекол с суспензией клеток от крыс, которым ввели оксфендазол, и 1" — от ког1трольных животных.

Под световьгм микроскопом (х7г1) в 10 полях зрения на кащ огг стекле подсчитывают число клеток, ггахсдяшихся на стадиях про-, ана-, мета- и те— лофазы и в интерфазе. Подсчитали общее число деляггл:хся и интерфазных клеток, определяли процентное сапер..:.ание клеток, находящихся на различи..х стадиях митоза н митотический индекс.

В результате опенки албснда. ола на антимитотическое действие установили, что при его введении крысам Вис; ар в

l дозе. 20 мг/кг процентное содержаггн. про-, мета-, ана- и телофаз соответственно равнялось 1,0-4 -1,14 91,66.+

+3, 11, 4, 12+1, 95 и 4, 16 " 24:", прот:гв аналогичных контрольных знач, ий 6,09 +2,40, 76,82+4,?4, 10,97+3,1, и 6 ОЫ

«+2,40%. Значение митотического индекса в популяции соматических клеток красного костного мозга опытных крыс через 4 ч после введения албендазола . равнялось 2,23 1,66 против 1,4Ы1,20 в контроле, т.е. больше 1г1%.

При введении этого же преп Ðàò беременным крысам-самкам на 9-й день ° эмбриогенеза уродливые плоды отсутствовали. Отмечался значительный эмбркотоксический эффект: так, предимплан+ тационная г.гбе.гь равнялась 4,".,,79> .гпостимплантацнонная — 82, 7э з,00 и о бщая эг гбриональная — 83, 61 ., 7 8 против контрольгп гх з наче:гий 1, 1; ., "7, 7+

7, 92+2, 70 и 1 9, 1 3 3, 68%. 1 езко сни зились масса и размеры плодов: 1,48+ .1,05 и 2,5 +0,04 против -2,20<0,03 г и

2,85+0,02 см в контроле.

Таким образом, из приведенных выше данных совершенно о-геяидно, что албендаэол обладая антимитотическим действиег:г для гон . IH. i.:! со. «гг-. ц- c":: .ëåток крас -cr o: сотного мозг. проявляет сильное эмбриотоксг-;ческо.. действие, проявляющееся в значитег ьном

1 7 ) 7.

Составитель А.Бобров

Техред Корректор М.Самборская

Редактор К.лазаренко

Заказ 25/ TAP cUK Подписное

ВНКЫИ Госудзрственвого комитета по изобретениям;. открытиям при ГЕНТ СССР

1 13035, Кос.ква, Б-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г,укгород, ул. Гагарина,101

7 увеличении пост- и общей эмбриональной гибели. Иезиду двумя э т:якн активностями имеется полная корреляция.

Применение способа позволяет сокра-Э тить срок определения эмбриотропной

3 активности производных бензимидазола с 1,5 месяцев до 2-3 дней.

Формула и э о б р е т е и и я

-10

Способ прогнозирования эмбриотропной активности производных бечзимидаэола, включающий введение исследуемоФ

rn препарата экспериментальному лмвотному, отличающийся тем, что, с целью сокращения срока определения, исследуют клетки красного костного мозга, определяют число метафаз и митотический индекс через 3-4 ч после введения исследуемого препарата и в случае, если указанные показатели увеличиваются по сравнению с контролем íà tOX и более, прогнозируют эмбриотропную активность исследуемого препарата,