Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК. (19) (!!) (я)5 А 61 К 37/66

ГОСУДАРСТВЕН Ы Й КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР!

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (89) HU 192254 (48) 02.01,86 (21) 7773679/14 (22) 11.12.84 (31) 4237/83 (32) 13,12.83 (33) HU (46) 23.02,92. Бюл. hh 7 (71) Эдьт Дьедьсерведьесети Дьяр (KU) (72) Миклош Тот, Валериа Эндрес. Илона

Белади и Шандор Тот (HU} (53} 615,7(088.8) .I (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ЛЕЙКОЦИТАРНОГО ИНТЕРФЕРОНА (57) Изобретение относится к медицине и касается способа -получения человеческого лейкоцитарного а- и у-интерферона. Целью

Изобретение относится к медицине. а именно к производству биопрепаратов, и касается способа получения человеческого лейкоцитарного интерферона.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения человеческого лейкоцитарного а- или у -интерферона, заключающийся в отделении фракции лейкоцитов, удалении из нее эритроцитов, культивировании суспенэии лейкоцитов в питательной среде и обработке соответствующим индуктором для индукции а- или. интерферона.

Однако известный способ позволяет получать на одной и той же культуре только а- или - интерферон.

Целью изобретения является получение на одной и той же культуре последовательно .а- иу-интерферона, изобретения является получение на одной и той же культуре лейкоцитов последовательно а- и у интерферона. Способ заключается в отделении фракции лейкоцитов крови (buffy coat), удаленйи иэ нее лейкоцитов, культивировании суспензии лейкоцитов в питательной среде. в присутствии 200

МЕ/мл а-интерферона в течение 2 ч. Индукцию осуществляют вирусом Сендай в концентрации 400 ГЕ/мм, культивируют 18 ч и отделяют надосадочную жидкость, содержащую а-интерферон. Осажденные клетки лейкоцитов промывают, суспендируют в питательной среде, обрабатывают конконавалином А, культивируют 16 ч и отделяют надосадочную жидкость, содержащую у интерферон.

Пример 1. Взятую кровь, помещенную в раствор АО (водный раствор, содержащий лимонную кислоту и декстроэу), в течение 3 ч хранят при 4 С. Одну объемную часть полученного таким образом концентрата лейкоцитов смешивают с пятью объемными частями 0,83%-ного водного раствора хлористого аммония при охлаждении на ледяной бане. Суспензия содержится на ледяной бане до тех пор, пока не произойдет лизирование эритроцитов (5-10 мин). После чего суспензию лейкоцитов культивируют в питательном растворе следующего состава, мг/л:

Хлористый кальций 175-350

Хлористый калий 300-500

Сульфат магния или эквивалентное количество хлористого магния

1713591

5000-7000

200-3500

Хлористый натрий

Бикарбонат натрия

Моноэамещенный фосфат натрия 30-150

Глюкоза 500-5500

Нитрат железа (! И) 0,0-0,2

При этом можно применять питательную среду Игла, модифицированную МЕМ

Дульбекко, модифицированную MEM Глазгова.

Указанное лиэирование зритроцитов повторяют таким образом, что на I об. ч. суспензии лейкоцитов рассчитывают применение 10 об. ч, 0,83 -ного водного раствора хлористого аммония. Образуется суспензия лейкоцитов в питательном растворе, вслед за тем число клеток устанавливают равным 10 клеток/мл. Питательный

„раствор содержит 2 мг/мл свободной от глобулина сыворотки человеческой крови (около 6О ). Клетки обрабатывают при 37 С при постоянном помешивании 200 МЕ/мл свободного от индуктора концентрированного человеческого а-интерферона. Через 2 ч клетки индуцируют 400 гемаглютинированных единиц вируса Сендая. Инкубацию заканчивают через 18 ч после индуцирования.

Антивирусный титр суспернативной жидкости, т.е, сырого а- интерферона, составляет

54, 200 EI/ìë, Клетки, использованные для получения а-интерферона один раз, промывают названным питательным раствором, после, чего образуется суспензия лейкоцитов в питательном растворе при концентрации 2,5 - 10 клеток/мл. Питательный раствор содержит 1 мг/мл свободной от глобулина сыворотки человеческой крови (около .37,). Затем клетки стимулируют посредством 15 мкг/мл конканавалина А. Инкубацию проводят при постоянном помешивании при 37 С и через 16 ч после индуцирования надоСадочную жидкость отделяют от клеток. Антивирусный титр надосадочной жидкости, которая содержит у интерферон, определяют на человеческих амниальных клетках WISH. Кроме того, титры выражаются в сравнении со стандартом человеческого а-интерферона в виде международных единиц(млМ/Е/мл), В настоящее время нет никакого признанного международного стандарта интерферона. Титр суспернативной жидкости составляет 10,600 МЕ/мл и является потенцированной величиной, поскольку препарагы у-интерферона содержат также гг-интерферон. С помощью градуирующей кривой и на основе титра первоначального и обработанного при значении рН 2 вещества фактическое содержаниему"интерферона составляет 1,840 ME/Mn.

5 Для сравнения вышеописанный способ проводят с.тем изменением, что клетки перед производством у-интерферона инкубируются в течение одного дня беэ обработки вирусов Сендая, Полученный под воздействием

10 конканавалина А титр у-интерферона составляет 340 МЕ/мл.

Для дальнейшего сравнения исключают первый, т,е. производящий а-интерферон период и изолированные лейкоциты инду15 цируют непосредственно конконавалином

А. Титр уинтерфнерона составляет 450

ME/мл.

П р и м е. р 2. Действуют аналогично примеру 1 с тем отличием, что в качестве

20 питательного раствора применяют питательную среду Игла. Полученный таким образом титр а-интерферона составляет

56,000 МЕ/мл. Во второй ступени способа в том же самом питательном растворе дости25 гается титр у"интерферона, равный 1,680

МЕ/мл. Если при этом способе исключить производство а-интерферона, то титр у интерферона составит 280 МЕ/мл.

Предлагаемый способ позволяет на одной и той же культуре лейкоцитов получать а- и у"интерфероны с высоким титром, Формула изобретения

Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона путем деления

35 фракции лейкоцитов крови, удаления из нее эритроцитов, культивирования суспензии лейкоцитов в питательной среде. обработки их индуктором интерферона и отделения надосадочной жидкости, содержащей ин40 терферон, отличающийся тем, что, с целью получения на одной и той же культуре последовательно а- и у-ирнтерферона, культивирование суспензии лейкоцитов проводят в присутствии 200 МЕ/мл а-интерфе45 рона в течение двух часов, в качестве индикатора используют вирус Сендай в концентрации 400 ГЕ/мл, культивируют 18 ч., отделяют надосадочную жидкость, содержащую а-интерферон, осажденные клетки

50 лейкоцитов промывают, суспендируют в питательной среде, обрабатывают конконавалином А, культивируют 16 ч и отделяют надосадочную жидкость, содержащую у интерферон.