Способ получения l-аланина

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения аминокислоты 1 -аланина, который может быть использован в сельском хозяйстве , химической, фармацевтической и пищевой промышленности. Целью изобретения является повышение выхода L-аланина. Способ заключается в использовании в качестве продуцентов L-аланина штаммов Brevlbacterium flavum ВКПМ В-3991 и B.flavum ВКПМ В-3992 (лабораторные номера АА5 и АА6 соответственно), недостаточных по D-аланину и одновременно устойчивых к D.-L- ааминомасляной кислоте. На среде с саза розой, аммонийным азотом, минеральными солями и растовыми веществами после 96 ч ферментации выход L-аланина достигает 43.82 г/л.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАР СТВЕ ННЫ Й КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4408234/13 (22) 26.04.88 (46) 15.03.92, Бюл, № 10 (71) Научно-исследовательский технологический институт аминокислот (72) А.Г.Азизян, М.А.Ананикян и Ш.М.Кочарян (53) 663.15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 182646, кл. С 12 Р 13/06, 1965.

Авторское свидетельство СССР

¹ 1367492, кл. С 12 Р 13/06, 1986. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАЛАНИНА (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения аминокислоты 1=аланина, который может быть использован в сельском хозяйИзобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения аминокислоты =аланина, который может быть использован в сельском хозяйстве, химической, фармацевтической и пищевой промышленности.

Целью изобретения .является повышение выхода 1 -аланина.

Способ заключается в следующем.

В качестве продуцентов используют мутантные штаммы Bravibacterium flavum, обладающие наряду с потребностью в

0-аланине устойчивостью к D,i= ааминомасляной кислоте.

Примерами штаммов продуцентов .аланина, недостаточных по О-алакину, обладающих устойчивостью к D,L- й-аминомасляной кислоте, являются следующие мутанты бактерий вида Brevibacterium

flavum: штаммы В,Панов АА5 и АА6, депонированные во Всесоюзной. коллекции про- „„б>Ц„„1719433 А1 (s1)s С 12 Р 13/06, С 12 N 1.5/ОО стве, химической, фармацевтической и пищевой промышленности, Целью изобретения является повышение выхода 1=аланина.

Способ заключается в использовании в качестве продуцентов L-аланина штаммов

Brevibacterium fiavum ВКПМ В-3991 и

В.fiavum ВКПМ В вЂ” 3992 (лабораторные номера АА5 и АА6 соответственно), недостаточных по 0-аланину и одновременно устойчивых к D,L- ааминомасляной кислоте. На среде с саэарозой, аммонийным азотом, минеральными солями и растовыми веществами после 96 ч ферментации выход L-аланина достигает 43.82 г/л.

MbluMGHHblx микроорганизмов под номерами ВКПМ В-3991 и ВКПМ В-3992 соответственно. иа-

Штаммы получены генетика-селекционными приемами из штамма B.flavum АТСС

14067 (коллекционный номер ВКПМ В-42).

Мутации устойчивости к 0,L- а- аминомасляной кислоте могут быть либо спонтанными, либо индуцированными в результате обработки микроорганизмов любым химическим (например, N-метил-N -литре-N-нитро1 зогуанидин) или физивеоким (например, ъ ультрафиолетовые лучи) мутагеном. Совмещение в геноме микроорганизмов мутации устойчивости к D,l= а — аминсмасля ной кисло-те и мутации осуксотрофности по 0-аланину может быть осуществлено в любой последовательности.

Получение штамма В,flavum ВКПМ В3991.

10

Штамм В.flavum ВКПМ В вЂ” 42 выращивают в мясопептонном бульоне (МПБ) при

30 С с аэрацией до достижения титра 10 клеток/мл, клетки отмывают от МПБ центрифугированием и ресуспендируют в цитратном буфере (рН 5,5). К полученной суспензии добавляют N-метил-N -нитро-N1 нитрозогуанидин (Н Г) до конечной концентрации 300 мкг/мл и инкубируют в условиях аэрирования в течение 20 мин при 30 С.

Затем клетки отмывают от мутаге на охлажденным МПБ, переносят в пробирки с 10 мл

МПБ, инкубируют в течение 1Â ч при 30ОС и рассеивают на поверхности среды следующего состава, мг/мл воды: глюкоза 20;

NazSO< 2; К2НРО4 1; NH4Gi з; ИН4Юз 1;

М9504 х 7М20 0,1; MnS04 х 5Н20 1 х 10

FeS04 х 7Hz0 1 х 10; биотин 5 х 10 "; тиомина хлорид 1 х 10 .; агар-агар 20; D,l=- ив аминомасляная кислота 30; рН 7,4.

Колонии, выросшие на этой среде после

4 — 5 сут инкубирования при 30 С, выделяют и проверяют их алолзинпродуцирующую способность, Один из отобранных таким способом мутантов, продуцирующий повышенные количества 0А-аланина, вновь обрабатывают НГ и отбирают мутанты, нуждающиеся для роста в D-аланине, известным методом. Штамм B.favum ВКПМ В3991 является одним из отобранных таким способом мутантов.

Получение штамма B.flàvum ВКПМ В3992.

Штамм В flavum ВКПМ В-42 обрабатывают НГ и отбирают мутант, нуждающийся в D-аланине. Полученный мутант вновь обрабатывают НГ и отбирают мутанты, устойчивые к D,l=а--аминомасляной кислоте, как это описано при получении штамма

В flavum ВКПМ В-3991, но с той разницей, что в состав среды вносят также D-алании в концентрации 0,1 мг/мл, Один из отобранных таким образом мутантов, продуцирующих повышенные количества (-аланина; обозначен В.flavum ВКПМ В вЂ” 3992, Штаммы-и родуценты L"àëàíèíà

В.flavum ВКПМ В вЂ” 3991 и ВКПМ 8-3992 по своим культурально-биохимическим признакам не отличаются от исходного штамма В.flavum ВКПМ B — 42, за исключением признаков устойчивости к DL- а — аминомасляной кислоте, ауксотрофности по Оаланину и L-аланинпродуцирующей способности.

Штаммы имеют следующую характеристику.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки овальные, слегка вытянутые, длиной 1,7 — 2,5 мкм, бесспоровые, неподвижн ые, грам пол ожител ьн ые.

На мясопептонном агаре (МПА) на 2 сут роста при 30 С образуют колонии диаметром 2 мм, круглые, гладкие, окрашенные в желтоватый цвет.

Штрих на МПА: на 2 сут рост умеренный, край гладкий, поверхность блестящая, плотная, цвет желтовато-кремовый.

Рост по уколу в МПА: умеренный, в основном на поверхности среды.

Минеральная среда Гловера с глюкозой: для роста необходим биотин, тиамин и

D-аланин, 2 сут роста при 30 C колонии диаметром 1 мм, цвет светло-кремовый. Рост штриха на 2 сут умеренный, плотный, цвет светло-кремовый, На картофере рост и образование пигмента с желтым оттенком.

Желатину на разжижают.

Физико-биохимические признаки.

Отношение к источникам углерода: ассимилирует глюкозу, сахарозу, маннозу, фруктозу, мальтозу; слабее — галантозу, рамнозу,сорбозу,сорбит,ацетат,этанол; не ассимилирует лактозу.

Отношение к источникам азота: ассимилирует аммонийный азот, мочевину.

Факультативные аэробы.

Оптимум роста при 30 — 32 С и рН 7,27,8, Отношение к антибиотикам: чувствительны к канамицину, тетрациклину, ампициллину, левомицитину (хлорамфениколу) и стрептомицину, Отношение к фагам: чувствительны к представителям всех известных на сегодняшний день 7 групп бактериофагов, лизирующих В.flavum, которые выделены на производстве лизина (группам ЭВ, Нф, Еф, Тф„Лф и Кф). Эти группы охватывают около

10 независимых фагочых изоляторов.

Условия хранения: в лиофилицированном состоянии; в пробирках с 0,7О/ МПА после посева уколом под слоем вазелинового масла; срок хранения —; на поверхности скошенного 1,5%-ного МПА в холодильнике при 4 С; пересевы через 1,5 мес.

Посевной материал штаммов-продуцентов для поступающей ферментации может быть приготовлен любым известным способом, таким как выращивание на поверхности питательных сред или в жидких питательных средах, содержащих усвояемые источники углерода, азота, неорганические соли и органические вещества, обеспечивающие рост штаммов.

К органическим веществам относятся витамины (биотин, тиамин), а также другие

171.9433

15

В качестве усвояемого источника азота 30

40 рез 6 — 10 ч после начала ферментации. Мак- .50 соединения, в том числе аминокислоты, если они необходимы для роста штаммов-продуцентов. Так, в состав посевных сред для выращивания штаммов ВКПМ В-3991 и

ВКПМ B-3992 необходимо вносить D или

О,! -аланин в концентрации не менее 80 мг/л.

В качестве питательной ферментационной среды для культивирования штаммов

В.flavum ВКПМ В-3991 и ВКПМ В-3992 могут быть применены питательные среды, содержащие усвояемые источники .углерода, ацетона, минеральные соли и органические . вещества, стимулирующие рост и накопление 1=аланина. В качестве усвояемых источников углерода могут быть использованы такие углероды, как сахароза, глюкоза, фруктоза, мальтоза, маниоза, крахмал, гидролизат крахмала и меласса; многоатомные спирты, такие как глицерин и сорбит; органические кислоты, такие как уксусная, молочная, фумаровая, малеиновая; спирты, такие как метанол и этанол, Указанные источники углерода могут быть использованы как в отдельности, так и в сочетании друг с другом в различных массовых соотношениях. Общее количество источника углерода . может быть введено в начале ферментации либо порциями в процессе ферментации. могут быть использованы как органические, .так и неОрганические соли аммония, например сульфат аммония, хлорид аммония, карбонат аммония, ацетат аммония, нитрат аммония, фосфат аммония, лактат аммония и аммиак; мочевина; различные природные азотсодержащие соединения, например пептон, гидролизат дрожжей, мясной экстракт и гидролизаты растительных белков.

В качестве минеральных солей могут быть использованы фосфорнокислый калий, фосфорнокислый натрий, сернокислый магний, хлористый натрий, соли железа, марганца, цинка, карбонат кальция.

Накопление L-аланина имеет место при культивировании в аэробных условиях в диапазоне температур 20-37 .С и значений рН

6,5-9;О.

Появление L-аланина наблюдается чесимальный уровень накопления L-аланина в культуральной жидкости достигается в результате полного потребления источнйка углерода через 32 ч и более (в зависимости от использования концентрации источника углерода). Степень конверсии источника углерода в целевой продукт колеблется от:0,17 до 0,29.

Весь аланин в культуральной жидкости находится в L-форме.

Содержание L-аланина определяют методом бумажной хроматографии и окраши5 вание нингидрином или с помощью аминокислотного анализатора.

Накопленный L-аланин может быть выделен из культуральной жидкости любым . известным способом, таким как удаление . клеток микроорганизмов и других нерастворимых частиц центрифугированием или фильтрацией, адсорбцией L-аланина на ионообменнике смолы с последующим элю- . ированием, концентрированием и кристаллизацией.

Пример 1. Посевной материал выращивают на посевной среде следующего состава, г/л воды: сахароза 30; сульфат аммония 30; калий фосфорнокислый однозамещенный 3; сульфат магния х 7НгО

1;сульфат железа х 7Нг0 0,01; сульфат марганца х 5Нг0 0,01; биотин 0,0001; тиамина бромид 0,0001; D-аланин 0,25; мел 30; рН

7,2.

5 Инокулят с концентрацией микроорганизмов 10 клеток /мл, полученный с односуточного посева с МПА, вносят в посевную среду в количестве 5; . Культивирование осуществляют в колбах на качалках при

30 С. Продолжительность процесса выращивания посевного материала 16-18 ч, при этом концентрация микроорганизмов достигает 2 — 5 х 10 клеток /мл.

В колбы объемом 250 мл асептически

5 разливают по 10 мл простерилизованной ферментационной среды следующего состава; г/л воды: сахароза 150; (МН4)г$04 55;

КНгР04 3; Mg$04 х 7Нг0 1; D-аланин 0.1:

FeS04 х 7НгО 0,01; MnSO4 х 5НгО 0,01; биотин 0,0002; тиамина бромид 0,00005; СаСоз

50; рН 7,5. Каждую колбу инокулируют одним из следующих штаммов: В flavum

ВКПМ В вЂ” 3991, ВКПМ В-3992 и известный штамм ВКПМ В вЂ” 3061, нуждающийся в О5 аланине, но не обладающий устойчивостью к О, L-а- -аминомасляной кислоте. Выращивание осуществляют на качалке при 30 С в течение 96 ч. Содержание L-аланина в культуральной жидкости штаммов приведено ниЖе:

П р и м e p 2, Процесс проводят аналогично примеру 1 с той разницей, что концентрация сахарозы в ферментационной среде

120 r/ë, а продолжительность ферментации

72 ч.

Содержание L-аланина в культуральной жидкости штаммов-продуцентов приведено ниже.

Формула изобретения

Способ получения L-алан ина, предусматривающий выращивание продуцирующего его штамма ВгеЖЬастег1цв flavum, Б нуждающегося в D-аланине, в условиях азрирования в питательной среде, содержащей сахарозу, 3MMGHNA сернокисль Й, калий фосфорнокислый, минеральные соли, О алач нин,биотин, тиамин, мел и воду, до макси10 мального накопления целевого продукта с последующим его выделением и очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода L-аланина, в качестве продуцента используют штаммы

15 Brevibacterium flavum ВКПМ 8-3991 или Brevibacterium ftavum ВКПМ В3992, дополнительно устойчивые к О,1= а-аминомасляной кислоте, . Составитель Л.A.Ìèíååâà

Редактор О.Спесивых Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Н .Король

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 741 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5