Способ определения отторжения трансплантата культур островковых клеток поджелудочной железы

 

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использовано для диагностики отторжения трансплантата культур островковых клеток поджелудочной железы. Цель изобретения - повышение точности диагностики. У больного производят забор крови, выделение лейкозвеси, инкубацию ее с инсулином и эритроцитами барана, с последующим определением розеткообразующих клеток и при их количестве 27% и ниже диагносцируют отторжение трансплантата. По сравнению с прототипом увеличивается точность способа на 26%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (53)5 G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ . зом, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4776808/14 (22) 02.01.90 (46) 15.03.92. Бюл, O 10 (71) .Львовский государственный медицинский. uHcTmyT (72) M.Ï.Ïaâëîâñêèé, Н.И.Бойко и А.M.Ñòåфанюк (53) 615 374(088.8) (56) Cenltzer О., Sawyer Т.А. Trans, proc. 1985, v. 17, р. 2558-2561, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОТТОРЖЕНИЯ ТРАНСПЛАНТАТА КУЛЬТУР ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ

ЖЕЛЕЗЫ

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использовано для выявления отторжения трансплантата.

Цель изобретения- повышение точности способа и сокращение сроков выявления отторжения трансплантата.

Способ осуществляют следующим обраЗабор крови у реципиента проводят из локтевой вены в количестве 10 мл утром натощак. Цельную кровь центрифугируют в

° течение 25 мин при 1500 оборотах в 1 мин в градиенте плотности фиколл-верографина.

Отбирают популяцию лимфоцитов и после трехкратного их отмывания в среде 199 (по

10 мин при 1500 об, в 1 мин) готовят суспензию, добавляя к осадку лимфоцитов 1 мл среды 199, механически гомогенизируютдо однородной смеси, из которой микропипеткой отбирают 0,05 мл и переливают в стеклянную пробирку, содержащую 0,4 мл

37 .-ной уксусной кислоты. Этой смесью заправляют камеру Горяева и проводят под„„ЯЯ „„1720009 А1 (57) Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использовано для диагностики отторжения трансплантата культур островковых клеток поджелудочной железы, Цель изобретения — повышение точности диагностики. У больного производят забор крови, выделение лейкозвеси, инкубацию ее с инсулином и эритроцитами барана, с последующим определением розеткообразующих клеток и при их количестве 277; и ниже диагносцируют отторжение трансплантата. По сравнению с прототипом увеличивается точность способа на 26, счет количества лимфоцитов в.5 рядах больших квадратов, Полученное количество лимфоцитов в камере Горяева разводят в среде 199 до концентрации 2х10 лимфоцитов в 1 мл среды 199.

Рабочий раствор инсулина для обработки лимфоцитов готовят следующим образом: автоматической микропипеткой набирают 0,004 мл простого инсулина для инъекций и разводят в 100 мл 0,9 -ного

„раствооа хлооида натрия. Из полученного раствора набирают 0,1 мл и добавляют к нему 0,1 Мп суспензии лимфоцитов в среде

199 (содержащий 2х10 лимфоцитов).

Смесь инкубируют 30 мин при 37 С, затем к ней добавляют 0,2 мл среды 199, центрифугируют 5 мин при 1500 оборотах в

1 мин, отбирают супернатант. Процедуру повторяют. Затем в осадку лимфоцитов добавляют 0,1 мл среды 199, суспендируют, добавляют 0,1 мл 0,05$-ной суспензии эритроцитов барана в среде 199. Инкубируют 10 мин при 37 С. Затем центрифугируют

2 мин при 1500 об./мин, ставят в холодиль1720009 ник при 4 С на 12 ч, Затем в пробирку добавляют 0,4 мл З -ного раствора глутарового альдегида в среде I99. Выдерживают 20 мин. Затем добавляют 0,5 мл дистиллированной воды и осаждают, цент- 5 рифугированием 2 мин при 1500 об./мин, Отбрасывают супернатант, а осадок клеток гомогенизируют шприцем с длинной иглой и готовят мазки. Высохшие мазки фиксируют 10 мин метиловым спиртом, окрашивают 10 по Романовскому, подсчитывают количество розеткообразующих клеток из 100 лимфоцитов. При показателях Т - 27 (и ниже устанавливают наступление иммуноконфликта. 15

Способ иллюстрируют следующими примерами.

Пример ". Больной А„1971 r. рождения; поступил в клинику хирургических болезней М 1 18.III.86 r. с диагнозом: 20 сахарный диабет, тип 1, тяжелая форма, диабетическая ретинопатия, полиневропатия, 19. I II.86 г. сделана внутримышечная аллотрансплантация культур островковых клеток из 6 поджелудочных желез трупов внутри- .25 утробных плодов человека 16-20-недельного срока развития. Культуру ткани иэ поджелудочных желез готовили согласно методических рекомендаций В.H.Áëeìêèна. 30

Перед трансплантацией количество Тлимфоцитов обработанных инсулином (Ти) =

62, через 10 сут после трансплантации уровень Ти — 60, через 14 сут уровень Т вЂ”

58, через 21 сутки Ти — 34 j, через 1 месяц 35 — Ти — 23; . Клинический эффект трансплантации проявлялся первые 3 недели: исчезли жажда, полидипсия, полиурия, уменьшились боли в ногах, снизился уровень глюкозы в крови с 17,6 мМоль/л до 6,8 мМоль/л, 40 в связи с чем снижена доза экзогенно вводимого инсулина на 26 ЕД. Спустя три недели начала увеличиться гликемия (10,2-14,6 мМоль/л) и соответственно увеличилась потребность в экзогенно вводимом инсулине. 45

Через месяц после трансплантации уровень

Т вЂ” 23 клинически эффект от трансплантации не наблюдался: больной вернулся к исходной потребности в инсулине (68 ЕД), появились полиурия и никтурия, что под- 50 твердило диагностический вывод, что пересаженные островковые клетки поджелудочной железы перестали продуцировать инсулин, т.е. наступил иммуноконфликт.

П р и м е-р 2. Больная Ц., 1971 r, рожде- 55 ния, поступила в клинику 7.YI.87 r. с диагнозом: иясулинозависимый сахарный диабет тяжелой степени, антигиопатия нижних конечностей, ретинопатия, неврит слухового нерва. 7, Yl.87 г. произведена внутримышечная аллотрансплантация культур островковых клеток поджелудочных желез, До пересадки уровень Ти составлял 57, через три дня Ти — 52, через десять дней—

277ь, через 14 дней — 25 . Уровень Ти к

10-му дню после трансплантации резко снизился, сделан вывод о начале отторжения трансплантата. Это подтверждается клиническим показателями: не снижался уровень глюкозы в плазме, удерживались жажда, полидипсия, боли в ногах, в связи с чем доза экзогеннога инсулина не была снижена.

Предлагаемым способом по иммунологическим данным можно предсказать криэ. отторжения пересаженных островковых клеток поджелудочной железы эа 5-7-е сут до клинического проявления криза отторжения, что не позволяет осуществить известный способ, ак как согласно известному способу можно лишь констатировать наступивший криз отторжения по соотношению

Т-лимфоцитов-супрессоров (TI) к Т-лимфоцитам-хелперам (Ти ).

В предлагаемом способе и редставлены данные о возможности раннего выявления отторжения на 10 больных со статистической обработкой результатов. Всего предлагаемый способ был апробирован на 62 больных, которым ранее была сделана аллотрансплантация культур островковых клеток поджелудочных желез, У 50 больных наступило приживление пересаженных островковых клеток поджелудочной железы.

При использовании предлагаемого crtoсоба возрастает точность диагностики на

267 (точность при использовании предлагаемого способа составляет 90, à rio известному 64 ).

Формула изобретения

Способ определения отторжения трансплантата культур островковых клеток поджелудочной железы, включающий забор крови, выделение лимфоцитов, инкубацию их с эритроцитами барана с последующим определением количества розеткообразую-, щих клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, перед инкубацией лимфоцитов с эритроцитами барана их дополнительно инкубируют с инсулином и при количестве роэеткообраэующих клеток 27 и ниже определяют отторжение трансплантата культур островковых клеток поджелудочной железы.