Способ определения антигена в растворе

 

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии,, и может быть использовано для определения антигенов в крови. Цель изобретения - повышение чувствительности и точности способа. Для этого антиген определяют в реакции ферментсубстратного взаимодействия, при этом взаимодействие комплекса антиген-антитело, меченного пероксидазой, с о-фенилендиамином в присутствии перекиси водорода проводят в темноте в течение 15 мин, затем реакционную смесь облучают светом при 420-460 нм до появления окраски, а после остановки реакции фотометрируют.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю G 01 N 33/531

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ .

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4745937/14 (22) 06,09,89 (46) 07.03.92. Бюл. М 9 (71) Таджикский государственный университет им. В. И. Ленина и Кооператив "Медсервис" (72) В. M. Меклер, С. M. Быстряк, С. П. Смотров и Д. Б. Сапрыгин (53) 615.475(088.8) (56) Ермолина Г. А. Вопросы мед. химии.

1986, М 1, с. 130-134. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА В

РАСТВОРЕ

Изобретение относится к иммунодиагностике, в частности к иммуноферментным способам специфических белковых и небелковых антигенов в пробе плазмы крови, и может быть использовано в кардиологии, хирургии и клинической медицине для диагностики различных патологических состояний.

Цель изобретения — повышение чувствительности и точности определения.

Способ осуществляется следующим образом.

Предварительно антитела, вступающие в иммунную реакцию, метят пероксидазой.

Образованный комплекс антиген-антитело, меченный пероксидазой, подвергают взаимодействию с хромогеном — о-фенилендиамином в присутствии перекиси водорода, останавливают реакцию кислотой и по оптической плотности окрашенного раствора определяют концентрацию антигена в,, Ы„„1718119 А1 (57) Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии,. и может быть использовано для определения антигенов в крови. Цель изобретения — повышение чувствительности и точности способа. Для этого антиген определяют в реакции ферментсубстратного взаимодействия, при этом взаимодействие комплекса антиген-антитело, меченного пероксидазой, с о-фенилендиамином в присутствии перекиси водорода проводят в темноте в течение 15 мин, затем реакционную смесь облучают светом при

420 — 460 нм до появления окраски, а после остановки реакции фотометрируют. исследуемой пробе, причем взаимодействие комплекса антиген-антитело, меченного пероксидазой, с о-фенилендиамином в присутствии перекиси водорода проводят в темноте в течение 15 мин, затем реакционную смесь облучают светом при 420-460 нм до появления окраски, а после остановки реакции фотометрируют при 492 нм, Пример 1. Определяемым антигеном является миоглобинспецифический белок, входящий в состав мышечных клеток, Для анализа использовали предварительно обработанный антителами к миоглобину и 1 jo-ной лошадиной сывороткой полистироловый планшет, хранящийся при -10 С, В лунки планшета вносили по 50 мкл растворов миоглобина — стандарта (от 1,25 до 160. нгlмл).

Одновременно в свободные лунки вносили анализируемую пробу сыворотки крови, разведенную в 10 раз 0,05 М фосфатным буфером рН 7,2. Растворы миоглобина-стан1718119 дарта и пробы инкубировали в течение 30 мин при 37 С. После отмывки водой в каждую лунку добавляли по 150 мкл разведенные 1:500 меченные пероксидазой антитела к миоглобину человека в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,2 и инкубировали в течение 30 мин при 37 С. Полученный комплекс миоглобин-антитело к миоглобину (комплекс антиген-антитело), меченный пероксидазой, использовали для измерения ферментативной активности, Для этого в каждую лунку добавляли по 50 мл субстратной смеси, содержащей о-фенилендиамин и перекись водорода, и помещали планшет в камеру без доступа света и выдерживали в темноте в течение 15 мин. Затем планшет извлекали из камеры и помещали под ртутную лампу типа ДРШ-1000, излучающую свет через светофильтры типа ШС-4 СС5. Спаренные светофильтры этого типа позволяют пропускать свет лампы только в диапазоне длин волн от 420 до 460 нм. Облучение реакционной смеси при 420 — 460 нм производили до получения окраски растворов в лунках планшета. После развития окраски ферментативную реакцию в лунках останавливали добавлением в них по 50 мкл 50 Д серной кислоты, а затем измеряли оптическую плотность полученных растворов в спектрофотометре типа Мультискан при 492 нм. По результатам оптической плотности растворов-стандартов строили калибровочную кривую и по ней рассчитывали концентрацию миоглобина в испытуемой плазме крови. Ее значение составило 56,8+2,7 нг/мл.

Пример 2. Определяли гаптен-медиатор симпатической нервной системы норадреналин, Для анализа использовали предварительно обработанный антителами к норадреналину и 1;(, лошадиной сывороткой полистироловый планшет, хранящийся при -10 С. В лунки планшета вносили по 50 мкл растворов норадреналина-стандарта (от 0,05 до 50 нг/мл). Одновременно в свободные лунки вносили анализируемую пробу крови, разведенную в 5 раз.0,05 М фосфатным буфером рН 7,2, затем добавляли в лунки по 50 мкл разведенный 1:100 меченный пероксидазой норадреналин и инкубировали в течение 30 мин при 37 С, Полученный комплекс норадреналин-антититела к норадреналину (комплекс антигенантитело), меченный пероксидазой, использовали для измерения ферментатив5

45 .50

55 ной активности. Для этого в каждую лунку добавляли по 50 мкл субстратной смеси, со- держащей о-фенилендиамин и перекись водорода, и помещали планшет в камеру без доступа света и выдерживали в темноте в течение 15 мин„Затем планшет извлекали из камеры и помещали под ртутную лампу типа ДРШ-1000, излучающую свет через светофильтры типа ШС-4+СС5 в диапазоне от 420 до 460 нм. Облучение реакционной смеси светом при 420 — 460 нм производят до получения окраски растворов в лунках планшета. После развития окраски ферментативную реакцию в лунках останавливали добавлением в них по 50 мкл 50/ серной кислоты, а затем измеряли оптическую плотность полученных растворов в спектрофотометре типа Мультискан при 492 нм. По результатам оптической плотности растворов-стандартов строили калибровочную кривую и по ней рассчитывали концентрацию норадреналина в испытуемой плазме крови. Ее значение составило 2 нг/мл, Помимо плазмы крови в качестве биологического объекта определения концентрации антигена предлагаемым способом может быть использована сыворотка крови или цельная кровь.

Чувствительность (минимальный порог определения) предлагаемого способа составляет 1,25 нгlмл, в то время как для способа-прототипа чувствительность составляет около 10 нгlмл. По статистическим данным коэффициент вариации для предлагаемого способа в 3,3 раза меньше, чем для прототипа. Это свидетельствует о повышенной точности предлагаемого способа,Формула изобретения

Способ определения антигена в растворе путем взаимодействия комплекса антиген-антитело, меченного пероксидазой, с хромогеном — о-фенилендиамином в присутствии перекиси водорода, остановки реакции кислотой, фотометрирования при 492 нм и определения концентрации антигена по оптической плотности исследуемой пробы, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности способа, взаимодействие фермента с субстратом осуществляют в темноте в течение

15 мин, затем реакционную смесь облучают светом при 420 — 460 нм до появления окраски.