Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l.-продуцент моноклонального антитела к гликопротеиду миелина головного мозга, угнетающего активность естественных киллеров человека

 

Изобретение относится к гибридомной технологии. Штамм (Ш) гибридных клеток получен при слиянии клеток мышиной миеломы Sp 2/0 с клетками селезенки мыши линии Balb/c, иммунизированной гликопротеидом мозга, связанным с миелином. Гибридные клетки продуцируют иммуноглобулины класса М. Прививка клеток Ш сингенным мышам вызывает у них образование асцитной опухоли. В асцитической жидкости мыши содержатся специфические антитела . Титр разведения асцитической жидкости в иммунрфермёнтном анализе 10 . Способность к продукций антител стабильно сохраняется на протяжении не менее 16 пассажей. Моноклоналкные антитела, продуцируемые Ш, способны подавлять на 40% естественную киллерную активность мононуклеаров периферической крови человека. Штамм депонирован под № ВСКК(П)453Д.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

tsi>s С 12 P 21/08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ. СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4795174/13 (22) 26.02;90 (46) 23.03.92, Бюл. М 11 (71) Институт цитологии АН СССР (72) Н.H. Аксенова, И.И, Фирулина, B.À.

Иванов, В.Я. Фель, B.À. Плескач, Т.Н, Игнатова, 3.В. Ковалева и И.В. Кожухарова (53) 578.085.23(088.8) (56) Mc garry R.Ñ. et al. Recognition of myellnassociated glycoprotein by the monoclonal

antibody. HNK-1,.Nature(London), 1983, 306,5941, р.376 — 378, (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХХ КЛ ЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L. — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К ГЛИКОПРОТЕИДУ МИЕЛИНА. ГОЛОВНОГО МОЗГА, УГНЕТАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬ ЕСТЕСТВЕННЫХ КИЛЛЕРОВ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано при изучении действия естественных киллеров (ЕК) крови человека. а также в медицине в диагностических целях и для оценки иммунологического статуса организма.

Известны моноклональные антитела (МонАт), выявляющие антигены на поверхностной мембране ЕК клеток. Среди них известны МонАт, полученные с использованием в качестве антигена связанного с миелином головного мОзга человека гликопротеида (MAG).ñ мол.м. 110 кД, на котором представлены эпитопы, распознаваемые МонАт Zeu-7 (или HNK-1), взаимодействующие с дифференцировочным антигеном HNK-1 ЕК крови человека.

Я2„„1721092 А1 (57) Изобретение относится к гибридомной технологии. Штамм (Ш) гибридных клеток получен при слиянии клеток мышиной миеломы Sp 2/О с клетками селезенки мыши линии Balb/c, иммунизированной гликоп. ротеидом мозга, связанным с миелином.

Гибридные клетки продуцируют иммуноглобулины класса M. Прививка клеток Ш сингенным мышам вызывает у них образование асцитной опухоли. В асцитической жидкости мыши содержатся специфические антитела. Титр разведения эсцитической жицкости в иммуноферментном анализе

10 . Способность к продукции антител стабильно сохраняется на протяжении не менее 16 пассажей. Моноклональные антитела, продуцируемые Ш, способны подавлять на 40% естественную киллерную активность мононуклеаров периферической крови человека. Штамм депонирован под М

В С К К(П)453Д.

Цель изобретения — получение штамма гибридомы, продуцирующей МонАт к антигену миелина мозга. влияющие на активность естественных киллеров (ЕК)..

Штамм гибридомы получают при гибри- . C) дизации клеток мышиной мйеломы Sp 2/О с Q клетками селезенки мыши линии Balb/c, ) иммунизированной связанным с миелином гликопротеидом белого вещества головного мозга человека (МАГ).

МАГ получают из белого вещества головного мозга человека и освобождают препарат от низкомолекулярных примесей согласно известным методикам. Из 5 г белого вещества головного мозга человека (трупный материал) экстрагируют глико- и липопротеиды мягкой гомогенизацией в 20кратном объеме 0,32 М сахарозы. Суспен1721092 эию центрифугируют в градиенте плотности

0,32-0,85 М сахарозы 30 мин при 75000 g.

Осадок, образовавшийся на границе двух сред, промывают 40-кратным обьемом дистиллированной воды в 3 приема с центрифугированием при 75000-30000 g. Затем осадок суспендируют в 20-кратном объеме.

0,32 М сахарозы и вновь подвергают градиентному центрифугированию в тех же условиях, что и первый раз, Полученный средний слой лиофипьно высушивают. Все процедуры проводят при температуре 2-40С.

1,5-2 r лиофилизированного белка делипидизируют 40 объемами смеси хлороформ,метанол (3;1) в течение 1 ч при встряхивании. Суспензию центрифугируют30 мин при 75000g. Осадок эфиром (10 мл) переносят в кол бу, эфир удаляют газообразным азотом, а осадок растворяют. в 20 мл 0,3

M Ll-дииодсалицилата на 0,05 M трис-буфере рН 7,4. Раствор депротеинизируют равным объемом водонасыщенного фенола.

После депротеинизации фенол и остатки Li-. дииодсапицилата убирают диализом против дистиллированной воды, а затем физиологического раствора.в общей сложности не менее 3 сут.(до удаления следов лития по показаниям пламенного фотометра). Если после диализа объем раствора превышает 8 мл, его концентрируют с помощью этиленгликоля, Полученный диализат центрифугируют 1 ч при 10000 g и затем выделяют на сефадексе G200 из водного раствора фракцию 100-110 кД. Эту фракцию используют как антиген при иммунизации мышей и тестировании моноклональных антител (МонАт).

Иммунизация животных.

Мышей линии Ва1Ь/с в возрасте 6-8 недель иммунизируют по следующей схеме; первую инъекцию проводят внутрибрюшинно -50 мкг МАГ с полным адъювантом Фроинда на мышь; Через 7 суток вну1 рибрюшинно вводят 25 мкг препарата с полным адъювантом Фрейнда на мышь.

Еще через 4 сут в течение 3 дн по 5 мкг .препарата на мышь без адъюванта вводят внутрибрюшинно и внутривенно. Через 2 сут после последней инъекции клетки селезенки берут на слияние. Перед слиянием в сыворотке крови иммунизированных мы; шей проверяют наличие антител к МАГ: в реакции преципитации в агвре получена отчетливая полоса преципитации при исполь. зовании 10 мкг белка и вдвое разведенной сыворотки крови. При тестировании имму ноферментным методом получена положительная реакция при использовании 0,7 мкг

МАГ на лунку и разведении сыворотки крови 1:1000, Получение гибридомы.

Спленоциты иммунизированной мыши сливают с клетками миеломы линии Sp 2/О в соотношении 5:1 с помощью полиэтипенг5 пиколя (мол.м.1500) в соответствии с обще. принятой методикой. После слияния смесь спленоцитов с клетками миеломы в гибридомной среде помещают в 96-луночные панели с нанесенными макрофагами

10 перитонеального эксудата мышей Ba1b/с.

На следующие. сутки в лунки добавляют равный объем гибридомной среды с удвоенным количеством ГАТ. Клоны гибридомных клеток появлялись на 5-7-е сутки после спия15 ния s 50-70 лунок. 8 эти сроки начинают . замену среды ГАТ. Тестирование наличия в среде МонАт к МАГ проводили иммуноферментным методом через 12-18 сут после слияния. Идентифицированные клетки-про20 дуценты клонируют на питающих слоях макрофагов, культивируют ин.витро или замораживают жидким азотом в смеси 90 эмбриональной сыворотки и 107; 0MSO.

Получение асцитной формы гибридомы.

25, Мышам линии Ва1Ь/с вводят внутрибрюшинно по 0;5 мл пристана. Через 8-10 дней этим мышам внутрибрюшинно вводят культуру гибридомных клеток в растворе

0,14 М МаО на 0,2 M фосфатном буфере pH .

30 7,2 по 1х10 клеток на мышь. Через 7-8 сут у мышей развивается асцит, от каждой мыши получают 2-7 мл асцитической жидкости. Клетки, отделяемые мягким центрифугированием (150 g, 7 мин, стериаь35 но) используют для дальнейших перевивок гибридомы, в асцитическую жидкость — как источник МонАт.

Анализ специфичности моноклонального антитела.

40 Культуральную среду исходных и вторичных клонов гибридомы, а также асцитическую жидкость проверяют на наличие

МонАт к МАГ иммуноферментным методом (EUSA), При тестировании используют 9645 ячеечные платы (фирма Flow), в каждую лунку которых вносят по 0,5-0,6 мкг антигена (МАГ) в 0,1 М карбонатном буфере рН 9,5; в качестве блокирующего белка используют яичный апьбумин в растворе PB рН 7,2, 50 Конъюгат пероксидазы с антимышиной сыsopot«oA (фирма Sigma) в разведении

1:1000 íà PBS с 0,5 альбумином. О ходе ферментативной реакции судят по изменению окраски о-фенилендиамина (Slgmà) в

55 разведении 1 мг/мл 0,1 М цитратного буфе- . ра рН 4,5. Все промывки между отдельными процедурами проводят раствором PBS pH

7,2 в присутствии 0,05 М Твина-20 и водой., Степень развивающейся окраски оценива1721092 ют в спектрофотометре-мультискане (фирма Flow) при длине волны 450 нм.

Взаимодействие МонАт с йоверхностными антигенами мононуклеаров определяют методом реакции непрямой иммунофлуоресценции в модификации для пробирок.

Для этого в пробирки к осадку мононуклеаров, выделенных в градиенте плотности фиколл-верографина, содержащему (3 — 4)х10

6 клеток добавляют 0,5 мл тестируемых МонАт, Время инкубации составляет 30 мин при

37 С в атмосфере 5 COz. Затем клетки отмывают 3 раза в растворе Хенкса и добавляет Г(ав) фрагменты, полученные из люминесцирующей сыворотки против иммуноглобулинов белой мыши (НИИ ЭМ им.А.Ф. Гамалеи). Клетки ресуспендируют и инкубируют 30 мин при 4 С. Затем клетки вновь отмывают 3 раза в растворе Хенкса и помещают на покровное стекло. Препараты высушивают и консервируют клетки 50 ным глицерином на физиологическом растворе. Регистрацию светящихся клеток на препаратах проводят на флуоресцентном микроскопе при просмотре 300-500 клеток, При определении цитотоксической активности ЕК-клеток крови человека в качестве клеток-мишеней используют культуру клеток зритробластоза человека К 562, ме,ченных Н-уридином (35 — 40 Бк на 10 клеток). Лимфоидные клетки-зффекторы (мононуклеары) получают из донорской крови человека в градиенте плотности фиколлверографина. Мононуклеары (no 7х10 клеток в 0,5 мл), обработанные МонАт в реакции связывания комплемента, инкубируют с клетками-мишенями в соотношении 1:25 в полной среде PPM 16-18 ч при температуре 37ОC в атмосфере 5% СО2. В контрольном варианте вместе МонАт используют питательнуюсреду

RPMI1640. Оставшиеся после инкубации неразрушенными клетки-мишени фиксируют на фильтрах и подсчет радиоактивности проводят.в толуольярм сцинтилляторе на счетчике

Векмап, О цитотоксической активности ЕКклеток до и после обработки их МКА МонАт судят по изменению цитотоксического индекса, определяемого по формуле радиоактивность опытной пробы, 100 x100, радиоактивность в контроле

Показано, что полученные МонАт снижают не менее чем на 40 цитотоксическую активность фракции мононуклеаров крови человека по отношению к клеткам культуры лимфобластоза человека К 562.

Физиологические и культуральные свойства штамма.

Штамм культивируют на ростовой среде

ДМЕМ с добавлением 10% эмбриональной

20 сыворотки, 1 MM заменимых аминокислот, 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ глютаминэ, 5.10

М меркаптозтанола и 40 ед,/мл гентамицина при 37 С в атмосфере 57ь СО2. Способ культивирования суспензионный. Время уд25 воения популяции 36 ч. Кратность рассева

1:3,2 три раза в неделю.

Криоконсервирование проводят в ростовой среде с. добавлением 10 диметилсульфоксида при концентрации (0,5-1).10

30 клеток в 1 мл, Жизнеспособность клеток штамма Н 10/2 после размораживания

70%. Прививка культивируемых гибридных клеток штамма Н 10/2 сингенным мышам

Ва1Ь/с вызывает у них образование асцит35

5

Для определения класса иммуноглобулинов исследуемых антител используют метод иммунодиффузии в агаре по общепринятой методике. В качестве контролей используют МонАт с известными изотопами. В качестве преципитирующего агента используют кроличьи антитела против мышиных антител (RAM). Реакцию проводят в ПЭГ, содержащем агар-агар 1ф, с

2 ПЭГ на 0,1 M ФСР, рН 8,6. В случае слияния изотопов — исследуемого и известного — происходит слияние линий преципитации в одну линию, в данном случае IgM u

IgM. В случае различия (IgM и IgG) слияния не происхоДит. ной формы опухоли, В асцитической жидкости содержатся . МонАт к дифференцировочному антигену HNK-1 ЕКклеток. Способность к продукции МонАт сохраняется при нескольких последовательных перевивках опухоли (не менее 16). Титр Ат определяли в разведении асцита не менее чем 10 . Клетки сохраняют жизнеспособность при переводе их на ростовую среду. При культивировании ин вива от одной мыши получают 2,5 — 7 мл асцитической жидкости (в среднем 4 мл).

Штамм депонирован в специализированной коллекции клеточных культур Института цитологии АН СССР— BCKK. Регистрационный номер депонирования — 453Д.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. N. ВСКК(П)453Д— продуцент моноклонального антитела к гликопротеиду миелина головного мозга, угнетающего активность естественных киллеров человека.