Способ определения чувствительности растений к факторам внешней среды

 

Изобретение относится к сельскому хо зяйству, и м.б. использовано для определения чувствительности растений к факторам внешней среды. В качестве тест-структуры растений используют хлоропласты. Критерием чувствительности является скорость ферментативной реакции при наличии субстрата фермента и ингибитора ферментативной реакции. В качестве фермента используют ацетилхолинэстеразу, в качестве субстрата - ацетилхолин. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСГ(УБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4645048/13 (22) 02.02.89 (46) 30.03,92. Бюл. (ч 12 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт электрификации сельского хозяйства и М ГУ им. M.Â.Ëoìoíoñoâà (72) Н,P.Áîðîäþê и Г.А.Шарков (53) 586(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 303023, кл, А 01 G 70/06, 1978. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ РАСТЕНИЙ К ФАКТОРАМ

ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано для оценки чувствительности растений к неблагоприятным факторам внешней среды физической или химической природы (например, повышенная или пониженная температура, пестициды и т.д,) при ускоренной ориентировочной качественной оценке большого объема исследуемого растительного материала.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения чувствительности растений к неблагоприятным факторам внешней среды;

Цель изобретения — повышение точности определения и упрощение способа.

Цель достигается тем, что согласно способу определения чувствительности растений к неблагоприятным факторам внешней среды, предусматривающе(лу отбор тестируемых растений, разделение их на контрольную и опытную группы, воздействие фактором на растения опытной группы, вы,,5U 1722313 А1

1 (1()5 А 01 G 7/00 (57) Изобретение относится к сельскому хозяйству, и м.б, использовано для определения чувствительности растений к факторам внешней среды. В качестве тест-структуры растений используют хлоропласты. Критерием чувствительности является скорость ферментативной реакции при наличии субстрата фермента и ингибитора ферментативной реакции. В качестве фермента используют ацетилхолинэстеразу, в качестве субстрата — ацетилхолин. 1 табл. деление из растений обеих групп фракций клеточной структуры, введение в них субстрата фермента и ингибитора ферментативной реакции — составление реакционных смесей, определение скорости ферментативной реакции в контрольной и опытной 4 смесях, их сравнение и признание растения опытной группы чувствительным к фактору () при уменьшении скорости фер(лентативной (1 реакции в опытной смеси по сравнению с д контрольной, в качестве клеточных структур используют хлоропласты, в качестве фермента — ацетилхолинэстеразу, а в качестве субстрата — ацетилхолин.

За счет отказа от нестандартного субстрата;ферментативной реакции (эритроцитов) повышается точность определения. За счет отказа от выделения липидной фракции из растений способ упрощается, Установлено, что ингибитор, который образуется в растении в ответ на воздействие на него неблагоприятным фактором, сосредоточивается в . хлоропластах.

1722313 10

50 опыте

Следовательно, их можно использовать в качестве той фракции, которую вводят в реакционную смесь. Процедура выделения хлоропластов значительно проще процедуры выделения липидной фракции растений, Установлено так>ке, что ингибитор, который накапливается в хлоропластах, ингибирует активность содер>кащегося в них фермента — ацетилхолинэстеразы. Следовательно, хлоропласты можно одновременно использовать и в качестве фермента, вводимого в реакционную смесь. Субстратом для фермента служит ацетилхолин.

В качестве стандартной используется реакционная смесь, содер>кащая выделенные из обработанного растений хлоропласты, ацетилхолин и ингибитор реакции ферментативного расщепления . ацетилхолина ацетилхолинэстеразой; параллельная реакционная смесь содержит хлоропласты, выделенные из данного растения до его обработки неблагоприятным фактором, ацетилхолин и ингибитор реакции ферментативного расщепления ацетилхолина ацетилхолинэстеразой.

Чем большее количество ингибитора обнаружится в хлоропластах обработан ного растения (чем больше угнетение реакции расщепления ацетилхолина наблюдается в реакционной смеси), тем более чувствительно данное растение к тому неблагоприятному фактору, которым на него воздействовали.

Пример 1. Из листьев гороха, используемых в контроле (без воздействия на растение повреждающего фактора) и в опыте (после воздействия на растение повышенной температуры) выделяют хлоропласты.

Для выделения хлоропластов 10 г измельченных листьев заливают 50 мл сахарозофосфатного буфера, рН 7,25(сахароза 0,3 М, КО 0,05 М, МцС!2 0,01 М, альбумин 0,5%).

Полученную смесь растирают 1 — 2 мин при

1-4 С, растертую массу отжимают через 6 слоев батиста и центрифугируют 3 мин при

+4 С при 4000 об/мин. Осадок ресуспендируют в растворе, содержащем 0,5 М сахарозы и 0,05 KCI, суспензию центрифугируют 2 мин при +4 С при 4000 об/мин, осадок ресуспендируют в 0,05 М трис-KCI буфера без сахарозы и суспензию выдерживают 30 мин при 1-4оC. Полученную суспензию выделенных хлоропластов вводят в реакционную смесь, которая содержит 0,1 M К-фосфатный буфер, рН 7,4, и ацетилхолиниодид, Готовят серию реакционных смесей, в которых в каждой из последующих смесей концентрация ацетилхолинаиодида на 0,2 мМ больше, чем в предыдущей. Таким образом, приготовлено 5 реакционных смесей, содержащих соответственно 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 м 1 мМ ацетилхолина, обьем 0,1 мл. В каждой реакционной смеси сойер>катся хлоропласты в количестве 10 -10 органелл/мл (хлорофилл 0,12-0,15 мг/мл), Обьем смеси составляет 50 мл. Реакцию осуществляют при

27 С В каждой из полученных смесей осуществляется реакция гидролиза ацстилхолиниодида в отсутствии ингибитора (контроль).

Параллельно готовят такую же серию реакционных смесей, в каждую из которых вводят по 0,4 мМ хлорофоса — ингибитора реакции ферментативного гидролиза ацетилхолина (опыт), затем такую же серию реакционных смесей с введением в них по 0,6 мМ хлорофоса (опыт), затем — с добавлением

0,8 мМ хлорофоса (опыт). Смеси ингибируют по 2 мин. 3а ходом реакции следят по выделению протонов, которые регистрируют потенциометрическим методом (изменение величины рН), Полученные данные,откладывают по оси ординат, а на оси абсцисс— время протекания реакции. Вычерчивают график зависимости величины рН реакционной смеси от продолжительности ее ингибирования и находят tgQ (угла наклона полученной кривой к оси абсцисс), который служит условной единицей, по которой судят о скорости ферментативной реакции в данной реакционной смеси

Экспериментальные данные скоростей реакции для различных концентраций ацетилхолиниодида в контроле (без хлорофоса) и в опыте (при ингибировании реакции хлорофосом) представляют в координатах Лануйвера-Берка (обратной скорости гидролиза ацетилхолина от его обратной концентрации). Это позволяет оценить кинетические параметры: константу Михаэлиса,. максимальную скорость реакции, константу ингибирования в опыте и о контроле.

Константа ингибирования о о

ЯатМ вЂ” гдето — начальная концентрация ингибитора; Wo — максимальная скорость реакции в контроле;

Wt — максимальная скорость реакции в

Скорость реакции ферментатипного гидролиза снижается под действием ийгибитора хлорофоса. Но угнетение. скорости этой реакции становится еще более выоа>кенным, если в реакционную смесь вводят хлоропласты из растения, подвергнутого действию неблагоприятного фактора.

1722313

Составитель Н. Бородюк

Редактор Л.Пчолинская Техред М.Моргентал Корректор Н. Ревская

Заказ 1002 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва; Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-.издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Г р и м е р 2. По методике по примеру

1 провели исследования жаростойкого сорта гороха к термическому воздействию.

Данный сорт не образует ингибитора в ответ на воздействие на него термического фактора, Пример 3. По предлагаемому способу оценили устойчивость трех сортов гороха к неблагоприятным факторам (см. таблицу).

Приведенные в таблице данные свидетельствуют о том, что образец !!! является наиболее устойчивым к повреждающим факторам, так как Ki = 0,88 мМ по сравнению . с образцом К! = 0,66 мМ, т.е. образец !!!— более термостойкий, чем образец (;

Формула. изобретения

Способ определения чувствительности растений к факторам внешней среды, предусматривающий отбор тестируемых растений, разделение их на контрольную и опыт. ную группы, воздействие фактором на рас/ тения опытной группы. выделение из растений обеих групп. фракций клеточной

5 структуры, введение в них субстрата фермента и ингибитора ферментативной реакции — составление реакционных смесей, . определение скорости ферментативной реакции в контрольной и опытной смесях, их

10 сравнение и признание растения опытной гурппы чувствительным к фактору при уменьшении скорости ферментэтивной реакции в опытной смеси по сравнению с контрольной, отл ича ющ.ийс я тем, что,с

15 целью повышения точности определения и упрощения способа, в качестве клеточных структур используют хлоропласты, в качестве фермента — ацетилхолинзстеразу. а в качестве субстрата — ацетилхолин.