Способ определения атфазной активности в тромбоцитах

 

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и может быть использовано для определения АТ- Фазной активности тромбоцитов человека при различных патологических состояниях, а также для диагностики ряда заболеваний человека. Цель изобретения - повышение чувствительности и ускорение способа - достигается за счет использования в процессе инкубации клеток аламетицина в концентрации 2-25 мг %, гепарина не менее 1,5 ед/мл, луброла РХ 25 мкг/мл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (»»

I,. »

1 .

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4747953/14 (22) 10.11.89 (46) 30.04.92. Бюл. М 16 (71) МГУ им. М.В.Ломоносова (72) В.Б.Ритов, Т.Ю.Авакян, Е,В.Меньшикова, Л,Б,Братковская, Р,Г,Шимон и X,Ì.Ìàðков (53) 612.015(088.8) (56) Сокольников А.А„Коданцева В,М., Гулидова Г.П., Миронова P.Ä. Вопросы мед. хим.

1988, М 2, с, 53-56. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АТФАЗНОЙ

АКТИВНОСТИ В ТРОМБОЦИТАХ

Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и может быть использовано для определения степени повреждения АТФазной активности тромбоцитов человека при различных патологических состояниях, Цель изобретения — повышение чувстBèTåëьности и ускорение способа.

Пример 1, 3 мл крови из срединной локтевой вены собирают в пробирку, содержащую 0,5 мл антикоагулянта следующего состава, %; цитрат натрия 2,5; лимонная кислота 1,4; Д-глюкоза 2. После осторожного перемешивания кровь центрифугируют при 150g в течение 9 мин, Полученную при этом обогащенную тромбоцитами плазму (около 1 мл) отбирают в другую пробирку и центрифугируют при 350g 7 мин. Осадок тромбоцитов суспендируют в 0,3 мл свежеприготовленной среды, содержащей мМ;

NaCI 150; KCI 2,7; MgCI2 1; НЕРЕЯ вЂ” NaOH

10 (рН 7,3 при 37 С), 0,35%-ный бычий сывороточный альбумин; гепарин 120 ед/мл, Все операции проводят в пластиковой посуде при комнатной температуре, Количество

„„ 42„„1730591 А1

2 (57) Изобретение относится к медицине, а именно к клинической биохимии, и может быть использовано для определения АТФазной активности тромбоцитов человека при различных патологических состояниях, а также для диагностики ряда заболеваний человека. Цель изобретения — повышение чувствительности и ускорение способа — достигается за счет использования в процессе инкубации клеток аламетицина в концентрации 2-25 мг%, гепарина не менее1,5ед/мл, луброла PX 25 мкг/мл. клеток в полученной суспензиии составляет

10 /мл (содержание белка тромбоцитов 2 мгlмл). Определение АТФазной активности в тромбоцитах проводят в течение 60 мин после их получения, при этом суспензию тромбоцитов хранят при 37 С. Определение АТФазной активности в тромбоцитах проводят путем измерения.гидролиза АТФ в стандартной среде энзиматическим методом по окислению НАДН, В снабженную мешалкой термостатируемую кварцевую кювету регистрирующего спектрофотометра помещают 3 мл стандартной среды инкубации (реакционной среды), содержащей, MM: NaCI 80; 15 KCI; Майз 5; М9С!2 3: Н Е Р ЕЯ вЂ” NaOH 10 (рН 72 при 37 С); НАДН 0 2; фосфоэнолпируват 0,25; АТФ 50 мкМ; пируваткиназа 2 ед,акт., лактатдегидрогеназа б ед.акт., бычий сывороточный альбумин 0,5 мг/мл. Затем включают самописец спектрофотометра и на бумажной ленте самописца устанавливают фоновое поглощение реакционной среды при 340 нм и чувствительности, равной 0,1 ед. оптической плотности на всю шкалу самописца (250 мМ). Не останав1730591 ливая движение ленты самописца, в реакционную среду вносят 50 мкл суспензии тромбоцитов, содержащей 0,5 10 клеток (100

8 мкг белка) и 6 ед, гепарина, затем вносят 3 мкл раствора аламетицина (25 мг/мл в 607;ном этаноле) и 3 мкл раствора детергента дуброла PX (25 мг/мл в воде). Регистрацию уменьшения оптической плотности реакционной среды на ленте самописца проводят

6 — 7.мин, Измерение АТФазной активности проводят два раза.

Для расчета АТФазной активности используют линейный участок записи уменьшения оптической плотности, который начинается через 2-3 мин после добавления луброла PX. 3a 2 мин реакции на линейной стадии средний сдвиг пера самописца составляет для донора А 25 мм или 0,005 ед. оптической плотности за 1 мин (ЛОз4о), Величина удельной АТФазной активности в тромбоцитах донора А, рассчитанная по формуле

ЛО з40 3 1000

6,22 мг белка составляет 24,1 нмоль Р/мин мг белка тромбоцитов, Пример 2. 6 мл крови из срединной локтевой вены собирают в пробирку, содержащую 1 мл антикоагулянта следующего состава, ; цитрат натрия 2,5; лимонная кислота 1,4; Д-глюкоза 2. После осторожного перемешивания кровь центрифугируют при 160 g в течение 9 мин, Полученную при этом обогащенную тромбоцитами плазму (около 2 мл) отбирают в другую пробирку и центрифугируют при 350 g 7 мин. Осадок тромбоцитов суспендируют в 0,5 мл свежеприготовленной среды, содержащей MM:

NaCI 150 мМ; KCI 2,7; MgCIz 1; НЕРЕЯ—

КАОН 10 (рН 7,3 при 37 С), 0,35%-ный бычий сывороточный альбумин; гепарин 120 ед/мл. Все операции проводят в пластиковой посуде при комнатной температуре. Ко, личество клеток в полученной суспензии равно 1,5 . 10 /мл (содержание белка тромбоцитов 3 мг/мл). Определение АТФазной активности в тромбоцитах проводят в течение 60 мин после их получения, при этом суспензию тромбоцитов хранят при 37 С.

Определение АТФазной активности в тромбоцитах проводят путем измерения гидролиза АТФ в стандартной среде энзи10

50 матическим методом по окислению НАДН, В снабженную мешалкой термостатируемую кварцевую кювету регистрирующего спектрофотометра помещают 3 мл стандартной среды инкубации(реакционной среды), содержащем мМ: NaCI 80; KCI 15; лайз 5;

MgCI23; НЕРЕЯ вЂ” NaOH 10(рН7,2 при37 С);

НАДН 0,2; фосфоэнолпируват 0,25; АТФ 50 мкМ, пируваткиназа 2 ед. акт., лактатдегидрогеназа 6 ед. акт„бычий сывороточный альбумин 0,5 мг/мл. Затем включают самописец спектрофотометра и на бумажной ленте самописца устанавливают фоновое поглощение реакционной среды при 340 нм и чувствительности, равно 0,1 ед. оптической плотности на всю шкалу самописца (250 мм), Не останавливая движение ленты самописца, в реакционную среду вносят 50 мкл суспензии тромбоцитов, содержащей

0,75 10 клеток (150 мкг белка) и 6 ед. гепарина, затем вносят 3 мкл раствора детергента луброла PX (25 мг/мл в воде), Регистрацию уменьшения оптической плотности реакционной среды на ленте самописца проводят 6 — 7 мин, Измерение АТФазной активности проводят два раза. Для расчета

АТФазной активности используют линейный участок записи уменьшения оптической плотности, который начинается через 2 — 3 мин после добавления луброла PX. За 2 мин реакции на линейной стадии средний сдвиг пера самописца составляет для донора Б 44 мм или 0,0088 ед. оптической плотности за

1 мин (Л Озеро). Величина удельной АТФазной активности в тромбоцитах донора Б. рассчитанная по формуле

ЛО з40 3 1000

6,22 мг белка составляет 28,2 нмоль Р/мин мг белка тромбоцитов, Чувствительность повышается в 2 раза.

Формула изобретения

Способ определения АТФазной активности в тромбоцитах путем инкубации клеток в среде, содержащей аламетицин с последующей регистрацией оптической плотности, отл ича ю щи йс я тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, инкубационная среда дополнительно содержит луброл и гепарин, при этом используют аламетицин в конечной концентрации 2 — 25 мг, гепарин 1,5 ед/мл на (0,4 — 1)10 тромбоцитов,