Способ определения содержания белка в дрожжевых клетках

 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для контроля за содержанием белка при лабораторном и промышленном культивировании дрожжевых клеток. С целью ускорения и повышения точности способа из дрожжевой суспензии, отбирают пробу, содержащую 0,9-1,5 мг биомассы , инкубируют ее со смесью детергентов , лизирующей клеточные мембраны, осаждают белок и клетки раствором 10%- ной трихлоруксусной кислоты и MgSO .осадок ресуспендируют в новом растворе и проводят реакцию с люминесцентным реагентом на аминогруппу (флуорескамин или ортофталевый альдегид). При проведении реакции с флуорескамином или ортофталевым альдегидом строят две калибровочные кривые, одна из которых отражает зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации белка в стандартном растворе , а другая от количества биомассы в пробе, и определяют предельно допустимые концентрации белка и.биомассы по меньшему из двух.предельных значений флуоресценции, а концентрацию Cg. мг/л, .дрожжевого белка рассчитывают по формуле Fx-Fo Сб С ст f-K , где Сетмаксимальная сл с концентрация стандартного раствора белка; FCT, Fo, FX - интенсивность флуоресценции контрольной, стандартной и измеряемой проб соответственно; f - фактор разведения - объем ресуспендированного осадка 7 объем исходной пробы; К - пересчетный коэффициент перехода от концентрации стандартного белка к концентрации дрожжевого белка. 1 з.п.ф-лы, 1 ил. Xi hO СЛ

СО!03 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕ С К ИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

4.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4806781/13 (22) 23.03.90 (46) 07.04.92. Бюл. № 13 (71) Институт фотобиологии AH БССР (72) В.Б.Гаврилов, С, В. Конев, P.Ä.Àäçåðèõî и B.Â.Xîðóøêèí (53) 631.5.9.581.19 (088.8) (56) Термихтаров Н.Г., Шульга А.В. Прикладная. биохимия и микробиология, 1974, т, 10, ¹ 6, с. 928-932.

Авторское свидетельство СССР

N 1401380, кл. G 01 N 33/48, 1988;

Методы экспериментальной микологии:

Справочник. — Киев: Наукова думка, 1982, 532 с, Wlets 3М. et al. Analytical Biochemistry..

1978, ч. 88, № 2, р, 513 — 521.

Поглазова M.Í. и др.. Микробиология, 1984, т. 53, № 1, с. 28-32. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА B ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТКАХ (57) Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано для контроля за содержанием белка при лабораторноми промышленном культивировании дрожжевых клеток. С целью ускорения и повышения точности способа из дрожжевой суспенэии отбирают пробу, содержащую 0,9-1,5 мг биомассы, инкубируют ее со смесью детергенИзобретение относится к микробиологии и может быть использовано для контроля за содержанием белка в клетках при лабораторном и промышленном культивировании дрожжевых клеток.

Целью изобретения является ускорение и повышение точности способа. Ы 1725121 А1 (я)ю G 01 N 33/48, С 12 0 1/02 тов, лизирующей клеточные мембраны, осаждают белок и клетки раствором 10 ной трихлоруксусной кислоты и MgSOp,îcàдок ресуспендируют в новом растворе и проводят реакцию с люминесцентным реагентом на аминогруппу (флуорескамин или ортофталевый альдегид). При проведении реакции с флуорескамином или ортофталевым альдегидом строят две калибровочные кривые, одна иэ которых отражает зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации белка в стандартном растворе, а другая - от количества биомассы в пробе, и определяЮт предельно допустимые концентрации белка и.биомассы по меньшему из двух. предельных значений флуоресценции, а концентрацию Cg, мг/л, дрожжевого белка рассчитывают по формуле

Сб =С ст +К, где Сст — максимальная

Fx о.

Ест о концентрация стандартного раствора бел- ф ка; Ест, Fo, Fx — интенсивность флуоресценции кантрольиой, стандартной и веай измеряемой проб соответственно; f — фактор разведения — объем ресуспендированного осадка / объем исходной пробы; К вЂ” ЬЭ пересчетный коэффициент перехода от концентрации стандартного белка к концентрации дрожжевого белка. 1 з,п.ф-лы. 1 ил.

Способ осуществляют следующим образом.

Отбирают пробу клеток из среды культивирования, дезинтегрируют клеточные мембраны путем 4-6 мин инкубации со смесью детергентов 0,02 об. тритона Х = 100 и 0,03-0,04 мас, цетил172 1121

20

40 считывают по формуле

50 триметиламмоний бромида, осаждают дезинтегрированные клетки в течение 10-15 мин инкубации с раствором 10 мас.% трихлоруксусной кислоты и 5,0 — 7,5 мас.%

MgS04 7Н20, центрифугируют, отделяют супернатант и разводят осадок буферным раствором, К ресуспендированному осадку добавляют флуоресцентный реагент на аминогруппу (флуорескамин или ортофталевый альдегид), проводят его реакцию с белком и измеряют интенсивность флуоресценции продуктов реакции (F).

На чертеже показаны кривые, характеризующие предлагаемый способ.

Для определения концентрации белка в . пробе строят две калибровочные кривые (см. чертеж ), одна из которых отражает зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации белка, а другая — от количества биомассы а пробе. По наименьшему из двух предельных значений флуоресценции (Епре Д, выше которых нарушается линейная зависимость F от концентрации белка, устанавливают диапазон измеряемых концентраций белка и биомассы. Настраивают чувствительность флуориметра на Ест = 100% по пробе с максимальной допустимой кон центра цией ста ндартного белка (Fct = Город), измеряют интенсивность . флуоресценции исследуемой пробы и рассчитывают концентрацию (мг/мл) дрожжевого белка Сб по формуле

Fx=Fo . .Сб=сст — -р f ê ст о где Сст — максимальная концентрация стандартного раствора белка;

Fc>, F0, Fx — интенсивности флуоресценции контрольной, стандартной и измеряемой проб соответственно;

f — фактор разведения — объем ресуспендированного осадка / объем исходной .пробы;

К- пересчетный коэффициент перехода от концентрации стандартного белка к концентрации дрожжевого белка.

Кроме того, при проведении реакции дрожжевого белка с флуорескамином с целью повышения чувствительности способа пробу дрожжевых клеток готовят в боратном буфере с рН 9,45 — 9,55.

Пример 1. Для определения белка в дрожжевых клетках C;maltosa, культивируемых на н-парафинах. по реакции с флуорескамином в предварительных опытах измеряют при фиксированной чувствительности флуориметра зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации в пробе дрожжевой биомассы и от концентрации стандартного белка (БСА). Устанавливают, что раньше (при F >F„) нарушается линейность сигнала для концентрации БСА.

По найденной величине FM определяют предельную концентрацию биомассы в пробе

С м - 0,63 мг/мл и максимальную концентрацию стандартного раствора БСА C2M =

-025 мг/мл. Затем в специальной серии 1020 проб параллельно проводят определение белка предлагаемым методом и методом

Кьельдаля и вычисляют пересчетный козффициент К = 1,48.

Далее способ осуществляют следующим образом. Отбирают 0,1 мл дрожжевой суспензии, взятой из 12-й секции промышленного ферментера и содержащей 19-24 мг/мл биомассы. Добавляют к ней 1 мл лизирующего реагента R>, пермешивают и инкубируют 2 — 3 мин, Затем добавляют 1 мл осаждающего реагента Rz, инкубируют 10 мин, центрифугируют 10 мин при 4 тыс об/мин. Полученный супернатант сливают и осадок ресуспендируют в 5 мл боратного буфера (0,1 М, рН 9,5);

Таким образом, фактор разведения исходной ДС f = 5 мл/0,1 мл = 50, что соответствует конечной концентрации биомассы С о = Сисх/f = 0,38 — 0,48 мгlмл и не превышает предельной концентрации

С1м = 0,63 мгlмл.

Теперь берут 0,5 мл ресуспендированного осадка, добавляют 0,2 мл люминесцентного реагента Вз с ФАМ. быстро перемешивают, инкубируют 4-5 мин и добавляют 3 мл боратного буфера (0,1 М, рН

9,5), Перед измерением флуоресценции проводят настройку чувствительности флуориметра "Квант-5" (F = 100%) по пробе со стандартным раствором БСА(+ 0,2 мл Ra 5 мин инкубации + 3 мл боратного буфера) Затем измеряют интенсивность флуоресценции в исследуемой пробе, при 4о,6=400 нм и Я сов = 480 нм Fx = 65. Также измеряют интенсивность флуоресценции контрольной пробы, Fo=5.

Содержание белка а исходной ДС расСдь (Fx-.г.о}+ К = 11, 68 мг/мл . ст о

Процентное содержание белка в клетках onределяют по формуле

С Б м мл 11,68

Пример 2. Для определения белка в дрожжевых t:.maltosa, культивируемых на н-парафинах, по реакции с ортофталевым альдегидом, так же как в примере 1, вначале измеряют зависимость интенсивности флу1725121 оресценции от концентрации дрожжевой биомассы и от концентрации стандартного белка(БСА). Устанавливают, что раньше при

Г >Ем нарушается линейность сигнала для концентрации биомассы. По величине Еу 5 определяют предельную концентрацию биомассы s пробе С1м = 6 мгlмл и максимальную концентрацию стандартного белка C2M=

- 1,5 мг/мл. Затем определяют пересчетный коэффициент от концентрации БСА к кон- 10 центрации дрожжевого белка К = 1,78. После этого проводят определение белка в исследуемой пробе, взятой иэ 12-й секции промышленного ферментера. К 0,1 мл пробы добавляют 1 мл лизирующего реа- 15 гента R i, инкубируют 2 — 3 мин, добавляют

1 мл осаждающего реагента 82, инкубируют 10 мин и центрифугируют образец в течение 10 мин при 4 тыс, об/мин. Супернатант сливают, а остаток растворяют в 20

0,6 мл 0,1 М NàOH. Это соответствует разведению исходной суспензии в 6 раз (f = 0,6 мл!0,1 мл = 6). При исходной концентрации биомассы Схл = 20 мг/мл конечная концентрация в разведенной 25 пробе составляет С конева = 3,3 мг/мл и лежит в середине линейного диапазона концентрированной зависимости F от Скл.

Затем проводят реакцию с ортофталевым альдегидом. Перед опытом к люминесцентному реагенту Из добавляют 10 мл дитиотреитола (на 10 мл Вз 0,5 мл, 30 мг/мл дитиотреитола в этаноле). Далее к 0,1 мл 35 ресуспендированного осадка добавляют 1 мл реагентав Яз, инкубируют 10 мин, добавляют 3 мл 0,5 М NaOH, инкубируют еще 10 мин и измеряют интенсивность флуоресценции Гк(4 э =365 нм, 2,л= 440 нм) на 40 флуориметре "Квант", предварительно на- страивают чувствительность флуориметра (F = 100 ) по пробе со стандартным раствором БСА Сст = Сгм = 1,5 мгlмл, Измеряют также интенсивность флуоресценции конт- 45 рольной пробы Fp = 10. Подставляют полученное значение интенсивности флуоресценции исследуемой пробы Fx = 78 и другие измеренные показатели в формулу и рассчитывают весовое содержание белка 50

Сдь -(78 — 10} 6 1,78 =12,1.мг/*in, 1,5

100 — 10

Процентное содержание белка в биомассе определяют по фромуле

Таким образом, в разработанном способе предложены менее трудоемкие и более эффективные операции дезинтеграции дрожжевых Клеток и их о.;а>кдения. Повышена точность определения концентрации белка за счет предварительной оценки линейной зависимости флуоресценции от концентрации стандартного белка и биомассы, установления наименьшего из двух пре дельных значений флуоресценций, по которому настраивают чувствительность прибора, а также определения пересчетного коэффициента К, учитывающего видоспецифичность флуоресцентного сигнала для различных белков.

Формула изобретения

1. Способ определения содержания белка в дрожжевых клетках. включающий дезинтеграцию клеток, осаждение белка раствором трихлоруксусной кислоты, проведение реакции белка с флуорескамином или ортофталевым альдегидом и определение содержания белка в пробе по флуоресценции продуктов реакции, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения точности способа, дезинтеграцию клеток проводят путем их обработки в течение 4 — 6 мин смесью Тритона Х-100 в концентрации

0,02 об. и цетилтриметиламмоний бромида в концентрации 0,03-0,04 мас., осаждение белка ведут в течение 10- 15 мин, при этом к раствору трихлоруксусной кислоты добавляют MgSO<.7HzO в концентрации 5,0-7,5 мас., при проведении реакции с флуорескамином или ортофталевым альдегидом строят две калибровочные кривые; одна из которых отражает зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации белка в стандартном растворе, а другая — от количества биомассы в пробе, и определяют концентрации белка и биомассы по меньшему из двух предельных значений флуоресценции, а концентрацию Сб., мг/л, дрожжевого белка рассчитывают по формуле где Сст — максимальная концентрация стандартного раствора белка;

Fct, Fp, Fx интенсивности флуоресценции контрольной, стандартной и измеряемой проб соответственно;

f — фактор разведения — объем ресуспендированного осадка/объем исходной пробы;

К вЂ” пересчетный коэффициент перехода от концентрации стандартного белка к концентрации дрожжевого белка.

1725121

2. Способ поп.1, отличающийся тем, что. с целью повышения чувствительно, сти способа при проведении реакции дрож80

40

20 мг/ы

О,I

0,2 Сд 0,3 С, мг/мд

Составитель Р.Адзерихо

Техред М.Моргентал Корректор О.Ципле

Редактор И.Горная

Заказ 1172 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по. изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул,Гагарина, 101

IOO жевого белка с флуорескамином, пробу дрожжевых клеток готовят в боратном буфере с рН 9,45-9,55.