Способ получения l-2-амино-4-(гидроксиметилфосфинил)- масляной кислоты

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения 1 -2-амино-4- (гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты , обладающей гербицидной активностью, которая может быть использована в качестве гербицида. Цель изобретения - ускорениепроцесса .Проводят трансаминирование 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты в присутствии ЫН2-донора (глутаминовой или аспарагиновой кислот, или их смеси) и трансаминазы (глутаминовая кислота щавелевоуксусная кислота трансаминазы, или глутаминовая кислота - пировиноградная кислота трансаминазы, или их смеси) или штаммов-продуцентов указанныхтрансаминаз: Streptomyces hygroscoplcus SF-1293 (PERM BP-130, АТСС 21705) или Streptomyces hygroscoplcus NP- 50 (PERM BP-1368), или Streptomyces Hvidans 66 (PERM BP-737). или Streptomyces albus IPO 13014 (ATCC 3004), или Streptomyces griseus IFO 12875 (ATCC 23345), или Streptovlricillium clnnamoneum IFO 12852 (ATCC 11874), или Streptomyces morookaensls IFO 13416 (ATCC 19166), или Nocardla medlterranei ATCC 21271, или Nocardlopsis dassonvillel ICM 3237, или Streptomyces vlrldochromogenes IFO 13347 (ATCC 14925), или Streptomyces virldochromogenes ICM 4977. или Micromonospora carbonaceae NRRL 2972 (ATCC 27114), или Escherlchia coll ATCC 10798, или Pseudomonas aeruglnosa ATCC 10145, или Pseudomonas cepacla ATCC 17759, или Serratia marcescens ATCC 13880, или Candida alblcans IAM 4829, или Mucor splnescens IAM M и З при рН 8-9, температуре 28-50°С и молярном соотношении 4- (гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты и МН2-донора 1:1-1:10. 6 табл. кяяа кс«& о о

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 Р 13/04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ. КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4202766/13

{22) 08.06.87 (31) 131743/86; 12513/87; 74476/87;

101152/87 (32) 09.04,86; 23.01.87; 30.03.87; 25.04.87 (ЗЗ) JP (46) 30,04.92. Бюл. ¹ 16 (71) Мейдзи Сейка, Лтд (JP)

{72) Сатоси Имаи, Такеси Мураками, Осаму

Хара, Синдзи Миядо, Еити Кумада, Хироюки

Анзаи, Нобухико Такане, Ятие Есизава, Тосинори Сайто, Хироси Огава, Хидехи Такеба, Ацуюки Сато, Коза Нагаока, Сунзо

Фукацу и Акира Окада (JP) (53) 577,15:66 (088,8) (56) Опубликованная заявка Японии Ь.

47485/82, кл. С 12 P 13/04, 1984.

Заявка ЕПВ № 135846, кл. С 12 P 13/04, 1985. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1.-2-АМИН0-4.(ГИДРОКСИМ ЕТИЛ ФОСФИН ИЛ)-МАСЛЯНОЙ КИСЛОТЫ (57) Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения L-2-амино-4(гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты, обладающей гербицидной активностью, которая может быть использована в качестве гербицида. Цель изобретения — ускорение и ро цесса. Проводят трансаминирование 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты в присутстИзобретение относится к биотехнологии и касается способа получения L-2-амино-4-(гидро ксиметил фосфин ил)-масляной кислоты, обладающей гербицидной актив„„!Ж „„1731067 А3 вии NHz-донора (глутаминовой или аспарагиновой кислот, или их смеси) и трансаминазы (глутаминовая кислота щавелевоуксусная кислота трансаминазы, или глутаминовая кислота — пировиноградная кислота трансаминазы, или их смеси) или штаммов-продуцентов указанн ы х трансаминаз: Streptomyces

hygroscoplcus SF-1293 (FERM BP-130, АТСС

21705) или Streptomyces hygroscoplcus NP50 (F E R M B P-1368), или Strep to myces

ИчЫапз 66 (FFRM BP-737), un Streptomyces

albus IFQ 13014 (АТСС 3004), или

Streptomyces griseus IF0 12875 (АТСС

23345), или Streptovlrlcilllum clnnamoneum

iF0 12852 (АТСС 11874), или Streptomyces

morookaensls lF0 13416 (АТСС 19166), или

Nocardia medlterranei АТСС 21271, или

Nocardiopsis dassonvillel ICM 3237, или

Streptomyces virldochromogenes I F0 13347 (АТСС 14925), или Streptomyces

vlrldochromogenes I СМ 4977, или

MIcromonospora carbonaceae NRRL 2972 (АТСС 27114), или Escherlchia соИ АТСС

10798, или Pseudomonas aeruginosa ATCC

10145, или Pseudomonas серас1а ATCC

17759, или Serratia вагсезсепз АТСС 13880. или Candida alblcans IAM 4829, или Mucor

splnescens lAM М и 3 при рН 8-9, температуре 28-50 С и молярном соотношении 4(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты и 1ч Н2-донора 1:1-1:10, 6 табл, ностью, которая может быть использована в качестве гербицида.

Известен способ получения L-2-амино4-(гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты формулы

1731067 о л мере одной трансаминаэой в присутствии

П по меньшей мере одного ЙНг-донора, на-.

СНз Р— Сн — СН вЂ” СБ — СОИ

I I пример L-глутаминовой или L-аспарагиноОН Кн вой кислот или их смеси, в водной среде, в включающий культивирование штамма- 5 которой растворены 4-(гидроксиметилфоспродуцента указанной кислоты с последую- финил)-2-оксомасляная кислота, NHz-донор . щим выделением целевого продукта из итрансаминаза. Процесс ведутпри рН 8,0о культуральной жидкости. 9,0 и температуре 28 — 50 С. Способ также

Недостатком указанного способа явля- можно использовать, обрабатывая 4-(гидроется большая длительность процесса, что 10 ксиметилфосфинил)-2-оксомасляную кислозатрудняет организацию промышленного ту не самой трансаминаэой, а штаммом производства продукта, микроорганизма, способным продуцироЦель изобретения — ускорение процес- вать по меньшей мере одну трансаминазу, При этом 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-окПаставленная цель достигается тем, что сомасляную кислоту и NH2-донор вводят в проводят трансаминиравание 4-(гидрокси- 15 питательный бульон микроорганизма, спометилфасфинил)-2-аксамаслянай кислоты в собнаго продуцировать трансаминазу, в коприсутствии глутаминовай или аспарагино- тором суспендированы не подвергнутые

-oA кислоты или их смеси в качестве ИН - химическому воздействию клетки штамма донора и в присутствии глутаминовая микроорганизма. кислота — щавелевауксусная кислота транс- Способ мо>кно осуществлять, обрабатыаминазы или глутаминавая кислота — пира- 20 вая 4-(гидраксиметилфосфинил)-2-оксомасвинаградная кислота трансаминазы, или их ляную кислоту экстрактам микроорганизма, смеси, или штаммав-продуцентав, указан- способного продуцировать трансаминазу, нных трансаминаз; Streptomyces содержащим эту трансаминазу, в присутстhy oscopicus SF-1293 (FERM BP-130, АТСС вии NH2-донора. Независимо от того. каким

21705); Streptomyces hygroscoplcus NP-50 25 образам осуществляют способ, 4-(гидрокси(FERM ВР-1368); Streptomyces Ilvldans 66 метилфосфинил)-2-оксамасляную кислоту (РЕАЛ BP-737); Streptornyces albus IF0 растворяют с начальной концентрацией ее

13014 (АТСС 3004); Streptomycез grlseus IF0 в водной реакционной среде 0,1-100 мг!мл.

12875 (АТСС 23345), Streptoverlclltium 1Лалярное соотношение 4-(гидроксиметилcinnamoneum IFO 12852 (АТСС 11874), 30 фасфинил)-2-оксомасляной кислоты и МН Я гeptomycesmorookaensls IF0134I6(ATCC донора составляет ат 1:1 — 10 в одной

l9 l66), КасагФа rnediterranei АТСС 21271; реакционной среде, Nocardinpsls dassonvlllei ICM 3237; При протекании реакции между 4-(гидStreptomyces vlrldochromogenes IFO 13347 раксиметилфосфинил)-2-окса ласлянай кис(АТ С С 14925); Stre pto m yce s 35 латай, МН донорам итрансаминаэай или клетками

vlrldochromogenes ICM 4977; прадуцирующего трансаминазу штамма

Mlcromonospora carbonaceae NRRL 2972 микроорганизма согласно изобретению (АТСС 27114); Escherlchla coli ATCC 10798; получается водный реакционный раствор, Psevdomonas aeruglnosa АТСС 10145; содержащий L-2-амина-4(оксиметилфосфиPseudomonas cepacla ATCC 17759; Serratia 40 нил)-масляную кислоту, непрореагировавшую

marcescens АТСС 13880; Candida а!Ысапз 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомаслянlAM 4888 или Mucor splnescens IAM Ми 3 ую кислоту, используемую трансаминаэу при рН 8,0-9,0, температуре 28 — 50"С и мо- или клетки используемого микроорганизма. лярном отношении 4-(гидроксиметилфос- Перед выделением целевого продукта из рефинил)-2-оксомасляной кислоты и 45 акционной смеси осуществляют центрифуМН2"донора 1:1 10. гирование для отделения клеток

Способ получения аминокислот транс- используемого микроорганизма. аминированием соответствующих оксокис- Выделение и очистку целевого продукта лот в присутствии глутаминовой или осуществляют пропусканием реакционной аспарагинавой кислот в качестве НН -доно- 50 смеси через колонку с катионообменной ра и ферментов-трансаминаз известен, од- смолой, такой как Дауэкс 50W, которой абнако для получения сарбируется целевой продукт, после чего

L-2-амина-(гидроксиметилфосфинил)-масл- осуществляют его элюирование водой или яной кислоты он используется впервые. разбавленным водным раствором аммиака.

Способ согласно изобретению осущест- 55 В результате получают фракции элюата, совляют следующим образом. держащие L-2-амина-4-(гидроксиметилфос4-(Гидроксиметилфосфинил)-2-оксомас- финил)-масляную кислоту. Фракции ляную кислоту обрабатывают по меньшей

1731067

55 злюента собирают и концентрируют при пониженном давлении, Пример 1, 4-(Гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляную кислоту растворяют в

50 Ммоль фосфатного буферного раствора (рН 6), содержащего глутаминовую кислоту — щавелевоуксусную кислоту трансаминазы, L-аспарагиновую и L-глутаминовую кислоты, служащие в качестве NHp-доноров.

Процесс ведут при 50 С в течение 50 мин. Затем реакционную смесь нагревают при 100 С в течение 3 мин для завершения реакции. Величину рН реакционной смеси доводят до 2 добавлением разбавленного водного раствора серной кислоты и осуществляют центрифугирование для получения поверхностного раствора, Количество целевого продукта в поверхностном растворе определяют аминокислотным анализатором, Пример 2. Штаммы, указанные в табл.

1, подвергают индивидуально инокулированию в 40-миллилитровых порциях среды разведения, включающей питательный бульон, после чего осуществляют культивирование при 28 С в течение 6 ч. Полученные питательные бульоны, используют для инокулирования с инокулумом 2 в 40-миллилитровых порциях питательной среды того же состава и кулитивирования в течение ночи при 28 С. B каждый из полученных питательных бульонов, содержащих клетки, вводят 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомэсляную кислоту до концентрации 100 мкг/мл.

B каждый иэ полученных бульонов вводят натриевую соль L-аспарагиновой кислоты в качестве МН2-донора до концентрации

100 мкг/мл. После этого осуществляют ферментную конверсию, протекающую при

28 С в течение 24 ч. Величину рН полученной смеси доводят до 2 посредством 25 ной серной кислоты для прекращения реакции. Клетки удаляют путем центрифугирования. Количество образующейся L-2а мино-4-(гидро кси метил фосф и н ил)-масляной кислоты, присутствующей в поверхностном растворе, определяют с помощью аминокислотного анализатора.

Результаты суммирования в табл. 1.

Пример 3. Штамм Streptomyces

hygroscoplcus SF-1293 (FERM BP-130) инокулируют в 10 мл предварительной среды разведения (включающей 2,0 растворимого крахмала, 1,0 полипептона, 0,3% мясного экстракта, 0,05% вторичного кислого фосфата калия, рН 7,0), культивируют при

28 С в течение 24 ч. Полученный питательный бульон используют в качестве затравочной культуры и инокулируют при

50 содержании инокулума 2 в питательную среду разведения, включающую, %: глюкоза 7; бактозиотон 4,4; вторичный кислый фосфат калия 0,32; вторичный кислый фосфат натрия 0,0852, N-трис-(оксиметил)метил-2-аминозтансульфоновэя кислота 1,15; хлористый кобальт 0,0001 (рН 6,0), и затем осуществляют культивацию штамма SF1293 при 28 С в аназробных условиях и при перемешивании. После культивации в течение 4 дн микробные клетки извлекают центрифугированием и промывают 50 мМ фосфатным буферным раствором (рН 6,0).

Затем зти клетки дезинтегрируют путем ультразвуковой обработки, после чего осуществляют центрифугирование с получением раствора сырого фермента.

В указанный раствор сырого фермента вводят 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляную кислоту до концентрации 100 мкг/мл и L-àñïàðàãèíoBóþ кислоту до концентрации.200 мкг/мл. Осуществляют также контрольный опыт с использованием

2-кетоглутаровой кислоты в качестве контрольного субстрата для реакции трансаминирования. После протекания ферментной реакции при 30 С в течение 2 ч реакционный раствор нагревают при 100 С в течение

3 мин для завершения реакции, Величину рН полученного раствора доводят до 2 разбавленной серной кислотой.

Раствор целевого продукта получают цент-. рифугированием данного реакционного раствора. Количество целевого продукта и глутаминовой кислоты, образующейся из кетоглутаровой кислоты, определяют с помощью аминокислотного анализатора, Получают: 1 -2-амино-4-(гидроксиметилфосфинил)-масляная кислота — 2,8 мкгlмл;

2-Кб глутаминовая кислота 67,9 мкгlмл (контроль), Пример 4. Используют штамм

Streptomyces hygroscopicus NP-50 (FERM P7804).

В колбе Эрленмейера емкостью 250 мл смешивают 20 мл питательного бульона штамма Streptomyces hygroscopicus NP-50, культивированного в течение 3 дн, 30 мл водного раствора 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты (концентрация 87 мг/мл; рН 7 0), 40 мл водного раствора L-глутамата натрия (концентрация

170 мг/мл) и 10 мл молярного буферного раствора трис-HCl (рН 8,5). Процесс ведут при осторожном взбалтывании полученной смеси при 37 С в течение 24 ч. Затем реакционную смесь центрифугируют для удаления из нее микробных клеток,. а поверхностный раствор, содержащий целевой продукт, анализируют с помощью ами1731067 нокислотного анализатора. Получают 14 мг/мл -2-амино-4-(гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты..

Пример 5. Используют штамм

Streptomyces livldans 66 (FERM BP-737), 5

В колбе Эрленмейера на 250 мл смешивают 20 мл питательного бульона штамма

Streptomyces llvidans 66, культивированного в течение 3 дн в питательной среде, 30 мл водного раствора 4-(гидроксиметилфосфи- 10 нил)-2-оксомасляной кислоты (концентрация 87 мгlмл, рН 7,0), 40 мл водного раствора L-глутамата натрия (концентрация

l70 мг/мл) и 10 мл 1 молярного буферного раствора трис-HCI (рН 8,5), При осторожном 15 взбалтывании полученной смеси при 37 С осуществляют ферментную реакцию, которая протекает в течение 24 ч. Зате ч полученную реакционную смесь центрифугируют для удаления из нее микро- 20 бных клеток. Полученный поверхностный раствор, содержащий образующуюся L-2амино-4-(гидроксиметилфосфинил)-масляную кислоту (100 мл), анализируют с помощью аминокислотного анализатора с 25 целью определения количества целевого продукта. Получают 6 мг/мл L-2-амино-4(гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты, Ниже приведены результаты, получен- 30 ные при использовании различных штаммов бактерий (табл. 2), дрожжей (табл, 3), актиномицетов (табл. 4), грибов (табл. 5), где

GIu — глутаминовая кислота, Asp — аспарагиновая кислота. 35

В табл. 6 приведены результаты, показывающие зависимость выхода продукта от концентрации NH2-донора и исходной оксокислоты.

Формула изобретения 40

Способ получения (=2-амино-4-(гидроксиметилфосфинил)-масляной кислоты формулы . О

ll !

CHq Р— СБ2- Cll -СН-. СООН 45

2 2 он зн отличающийся тем, что, с целью ускорения процесса, проводят трансаминирование 4-(гидроксиметилфосфинил)-2-ок- 50 сомасляной кислоты в присутствии глутаминовой или аспарагиновой кислот или их смеси в качестве NH2-донора и глутаминовая кислота — щавелевоуксусная кислота трансаминазы или глутаминовая кислота — пировиноградная кислота трансаминазы, или их смеси, или штаммов-продуцентов укаэанных трансаминаз Streptomyces

hygroscopicus SF-1293 (FERM BP-130, АТСС

21705) или Streptomyces hygroscopicus NP50 (FERM BP-1368), или Streptomyces

Iivldans 66 (FERM ВP-737), или Streptomyces а!Ьоз IFO 13014 (АТСС 3004), или

Streptomyces grlseus IFO 12875 (ATCC

23345), или Strepto-vlricliiium cinnamoneum

IFO 12852 (АТСС 11874 ), или Streptomyces

morookaensis IFO 13416 (АТСС 19166), или

Nocardia mediterranei АТСС 21271, или

Nocardiopsls dassonvillel ICM 3237, или

Streptomyces virldochromogenes ICM 4977, или Streptomyces viridochromogenes IFO

13347 (АТСС 14925), или Mlcromonospora сагЬопасеае МЯЯ 2972 (АТСС 27114), или

E she rich!a coll АТСС 10798, или

Pseudomonas aeruglnosa АТСС 10145, или

Pseudomonas серас!е АТСС 17759, или

Serratla marcescens АТСС 13880, или

Candida aIbicans IAM 4829, или Mucor

spinescens IAM МиЗ при рН 8,0 — 9,0, температуре 28 — 50 С и молярном соотношении

4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты и NH2-донора 1:1-10.

Приоритет по пунктам 9,04,86: проводят трансаминирование

4-(гидроксиметилфосфинил)-2-оксомасляной кислоты в присутствии глутаминовая кислота — щавелевоуксусная кислота трансаминазы или глутаминовая кислота пировиноградная кислота трансаминазы, или их смеси, или штаммов-продуцентов указанных трансаминаз, SF-1293 ATCC

10145, АТСС 13880, АТСС 9341.

23.01.87: в присутствии глутаминовой кислоты в качестве NH2-донора, штаммов

NP-50 — FERM BP-737.

30.03.87: в присутствии штаммов-продуцентов указанных трансаминаз IFO 13014, iFO 12875, IFO 12852, IFO 13416, АТСС

21271, ICM 3237, ICM 4977, IFO 13347. ЯВЯМИ

2972, АТСС 17759, AM 4829, АМ МиЗ.

25.04.87: в присутствии аспарагиновой кислоты в качестве NH2-донора или их смеси.

1731067

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Выход продукта, мг/мл штамм актиномицетов

Glu

Asp

7,4

1,0

1,7

0,3

6,0

10,6

7,5

6,0

2,6

0 1

6,3

1,5

1,6

9,5

6,1

8,8

Выход продукта в зависимости от штамма

Выход продукта при использовании бактерий

Выход продукта при использовании дрожжей

Выход продукта при использовании актиномицетов

Streptomyces albus IFO 13014 (АТСС 3004) — Streptomyces griseus IFO 12075 (АТСС 23345) S t rep tover ic il l ium!. cinnamoneura

IFQ 12852 (АТСС 11874) Streptomyces morookaensis IFO 13416 (АТСС 19166) Nocardia mediterranei ATCC 21271

Nocardiopsis dassonvillei ТСИ 3237

Streptomyces viridochromogenes

IFO 13347 (АТСС 14925) Micromonopora carbonaceae NRRL 2972 (АТСС 27114) Streptomyces viridochromogenes ?СИ 4977

1,4

5,6

1731067

Таблица 5.Выход продукта при использовании грибов.Таблица 6

Начальная концентрация NHz-доно а, г/мл

Начальная концентрация оксокислоты,мгlмл

Выход продукта, г/мл

Опыт

L-гл юта мат н а- L-adnap ax нат ия т ия

П р и м е ч а н и е; опыт 9 осуществляют при 50 С и рН 9,0, а опыт 11 - при 450C и рН

8,5, Ссставитель О.Скородумова

Техред M.Mîðrâíòàë Корректор ТЯалий

Редактор М.Келемеш

ЗаКаз 1520 . Тираж. Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород. ул.Гагарина, 101

2

4

6

8

10000 гоооо

40000

10ООО

40000

0. 0. 10000

10000

30000

0

40000

40000

32840