Способ получения ядерных фракций, обладающих протеиназной и ингибирующей активностью

 

Изобретение относится к физиологии и биохимии растений. Целью изобретения является повышение выхода и активности целевого продукта. Растительную ткань консервируют в глицериновой среде, ядра последовательно обрабатывают сначала возрастающими концентрациями хлористого натрия в присутствии 0,5% тритона Х-100, затем растворами гуанидин гидрохлорида с / -меркаптоэтанолом и 0,5 н, щелочью натрия . Проводят аффинную хроматографию на сефарозе 4В с иммобилизованным либо трипсином, либо ингибитором трипсина . 3 ил., 4 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s С 12 N 9/50

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4785583/13 (22) 07,02.90 (46) 15.05.92. Бюл. М 18 (71) Институт биологии Башкирского научного центра Уральского отделения АН СССР (72) Э. А. Иванова и Г, Х, Вафина (53) 66. 098(088,8) (56) Бюллетень Всесоюзного селекционно-генетического института, Одесса, 1981, с. 42-49.

Экологические аспекты гомеостаза в биогеоценозе. Уфа, 1986, с. 56-60. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯДЕРНЫХ

ФРАКЦИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТЕИНАЗНОЙ И ИНГИБИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к физиологии и биохимии растений, может быть применено в молекулярной биологии развития при оценке функционального состояния интерфазных ядер.

Цель изобретения — повышение активности и выхода ядерных трипсиноподобных протеиназ и их ингибиторов.

Способ заключается в том, что перед выделением клеточных ядер растительную ткань консервируют, а очистку ядер проводят раствором, содержащим 0,5% тритон

Х-100 с последующей экстракцией ядерных фракций возрастающими концентрациями

0,14 М, 0,35 М, 2 М хлористого натрия, 6 M гуанидин гидрохлорида с 0,1% 9-меркаптоэтанолом и 0,5 н, раствором гидроксида натрия при сопутствующей аффинной хроматографии вышеперечисленных ядерных фракций на сефарозе 4 В с иммобили,,5U ÄÄ 1733471 А1 (57) Изобретение относится к физиологии и биохимии растений. Целью изобретения является повышение выхода и активности целевого продукта. Растительную ткань консервируют в глицериновой среде, ядра последовательно обрабатывают сначала возрастающими концентрациями хлористого натрия в присутствии 0 5 тритона X-100, затем растворами гуанидин гидрохлорида с

Р-меркаптоэтанолом и 0,5 н, щелочью натрия. Проводят аффинную хроматографию на сефарозе 4В с иммобилизованным либо трипсином, либо ингибитором трипсина. 3 ил„4 табл.

1 зованным трипсином либо ингибитором трипсина, Пример. Опыты проводили на покоящихся, 1-2-дневных проростках, 3-4-дневных тканях колеоптилей и листьев пшеницы (1

Московской-35, Мироновской озимой и яровой, Проростки выращивали при температуре 250С в термостатированной камере между слоями фильтровальной бумаги, смоченной дистиллированной водой. Отделенные от эндосперма зародыши, проростки, 1 колеоптили и листья в течение 3 с промывали холодным эфиром и многократно дистиллированной водой, Проростки и ткани консервировали при -250C в 80-90 -ном глицерине. Затем зародыши, проростки и ткани заливали гомогенизационной средой:

20% глицерин; 0,005 М МзС!2, 0,025 М KCI;

0,003 М CaCIz; 0,005 М NaCI, 0,004 М Р-меркаптоэтанол; 0,02 триэтаноламин (ТЭА)

HCI рН 6,8; 0,004 M н-октиловый спирт, Го1733471 последовательных экстракций 0,35 М NaCI на том же буфере.

Далее осадок фракционировали суспендированием в трис-HCI буфере с 2 М NaCI. 55

В осадке оставалась фракция, содержащая ядерный матрикс. Последующую экстракцию проводили 6 М гаунидин гидрохлоридом с 0,1%-ным,В-меркаптоэтанолом на трис-HCI буфере рН 6,8 (ядерный матрикс i), могенизацию проростков проводили 7 с при

15 000 об/мин (гомогенизатор МПВ-302, Польша). Гомогенат фильтровали через 1 слой фланели, флюзелина и 3 слоя капрона (размер пор 70 мкм ), С грубым остатком растительного материала гомогенизацию и фильтрование проводили еще 2 раза 15 с и

30 с при 15 000 об/мин. Объединенные гомогенаты центрифугировали при 500 об/мин (ЦЛР-1, СССР) в течение 5 мин с целью освобождения от грубых неразрушенных тканей и целых клеток, затем надосадок центрифугировали при 2700 об/мин (К-23, ГДР) в течение 20 мин, Осадок ядер собирали суспендированием средой гомогенизации (50 мл) и наслаивали на прерывистый глицериновый градиент, состоящий из 5 слоев (по

30 мл) возрастающей концентрации глицерина (50, 60, 70, 80, 90 вес/объем), и риготовленный на ТЭА HCI рН 6,8 со всеми перечисленными компонентами гомогенизационной среды, исключая 20 / -ный глицерин. Градиентное центрифугирование проводили при 2 000 об/мин в течение 1 ч (ЦЛР-1., СССР). Осадок ядер промывали

0,5%-ным тритоном Х-100 на среде гомогенизации, но без глицерина, с последующим ценгрифугированием при 2 700 об/мин (К23, ГДР) в течение 15 мин, после чего ядра промывали трижды в среде следующего состава. 0,005 M MsCb; 0,025 М KCI; 0,003 M

СаС!г. п,005 M NaCI; 0,01 М трис-HCI рН 6,8 с последующим центрифугированием при указанных условиях. 7%-ным тритоном Х100 промывать ядра нельзя, т.к. они набуха:от и разливаются, Степень чистоты выделенных препаратов клеточных ядер определяли микроскопи:<вски, спектрофотометрически и по компонентному составу клеточных ядер (белок/ДНК, РНК/ДНК, табл. 1).

Сравнение процентного выхода ядер и их удельной ферментативной активности при использовании сахарозо-гуммиарабикового и глицеринового методов изоляции ядер представлено а табл, 2.

Из очищенных препаратов ядер нуклеоплазматические белки экстрагировали при низкой ионной силе 0,14 MNaCI, 0,01 M трис-HCI рН 6,8 буфером. Непрочносвязанные ядерные белки выделяли путем трех

45 остаточные компоненты экстрагировали 0,5 н NaOH (ядерный матрикс II). Все фракции ядерных компонентов получали путем трех посл едовател ьн ых экстра кций. Достаточность экстракций контролировали по выходу белка, Ядерные фракции хранили при

-196 в азоте, Аффинную хроматографию проводили на колонках (1 Х0,5 см) либо с иммобилизованным трипсином("СПОФА", ЧССР), либо ингибитором трипсина ("Reanal", Венгрия), ковалентно присоединенных к CNBr-активированной агарозе (Институт химии АН ЭССР).

Протеиназную активность трипсина и трипсиноподобных протеиназ опредегяли по расщеплению низкомолекулярного белка протамина ("Caibiochem", США), Количество освободившегося аргинина рассчитывали, пользуясь калибровочным графиком, В качестве стандарта использовали D, 1=аргинин ("Веаг<аГ, Венгрия). Активность трипсиноподобных и ротеиназ и их ингибиторов выражали в нмоль аргинина на

1 м г бел ка/с.

Анализ полноты выделения ядерных фракций (табл. 3) показзл, что все фракции представляют собой не чистый белок, а комплексы нуклеиновых кислот и белка.

Эффективность последовательной ступенчатой экстракции трипсиноподобных протеиназ и их ингибиторов с последующей идентификацией либо на колонках с иммобилизованным трипсином, либо ингибитором трипсина г<родемонстрирована на фиг.

1, 2, На оси ординат (фиг. 1) показано содержание протеиназных и ингибиторных нуклеопротеидных комплексов в расчете MKI белка на 10 000 штук семян, На оси абсцисс указан возраст проростков от покоящихся зародышей (О) до 2-суточных проростков;

3-4 суточные колеоптили; 3-4 суточные листья; 3-4 суточные корни, Использованы следующие обозначения: 1-нуклеоплазма, 2-непрочносвязанные белки хроматина, 3ос нов н ые белки хроматина, 4-я дерн ый матрикс I, 5-ядерный матрикс II, А-протеиназы, Б-ингибиторы протеиназ, Если из ядер выделить нуклеоплазму (0,14 M NaCI), а затем сразу их экстрагировать 0,5 í Na0H (фиг. 2), то мы не получим эффекта, который изображен на фиг. 1, т,е. нарушение приведенной последовательности экстракций не дает эффекта выделения трипсиноподобных протеиназ и ингибиторов.

На фиг. 2 на оси ординат показана оптическая плотность растворов при длине волны 280 нм, а по оси абсцисс указаны номера проб, На фиг. 2 даны следующие обозначения: 1-колонка с иммобилизованным ингибитором трипсина, Il-колонка с им1733471

Таблица 2

Выход ядер, о/

19 ч-2

60 + 10

Таблица 3 отношения

Фракци ядер

26.0

0.6

0.2

0.1 1

0.54

0,24

157

2 + 1,5

1+ 0,45 и 0,05

478 !

112

2 +.0,5

Таблица 4 нгибитор доб азы трипсина

8,4 i 8,2

108 12

69.2

Способ получения ядер (К

Сахарозо-гуммиарабиковь

Глицериновый

Ядерная сусп

Нуклеоплаз (0,14 М Na ! Непрочносвяз белки (0,35 M

Основные бе хроматина (2 M NaCI) 5 0,8

Ядерный матрикс (6 M гуанидин гидрохлорид+ Р-меркапто-,,24 +-0.5 этанол )

Ядерный матрикс II 45 (0.5 í NaOH) 4-дневные листья — — 1 вность трипсиноподоб- II

1 протеиназ в белковых иях проростков пшени- Ij субстрату БАЭ Э H CI

Еlмг белка/мин

0.188 + 0.020

0,564 - 0.020

P Í К/ Белок/

Д Н К, P I-I K

0.5

5.9 !

7.7

7,4 (291

РНК! . Белен! - - -1

0 0

0.9, 15, 1

1733471

Таблица 1

А 280)260

1! РН К/ДН К 1

„— Г-— ты " А2во)2 иеся ши

0.87

1.15 ные тки

2-дневные проростки

3-дне вн ые олеоптили

3-дневные листья

4-дневные олеоптили

4-дневные листья

0.80

0,81

5,2

3. 61

0,81

1,29

0.30

3,6

0,75

1,15

0.40

0,63

4,6

1,22

0,27

4.6 . !

3.2

0,80

1,29

0.25

0,60 мобилизованным трипсином, "а" — трипсиноподобные протеиназы. "б" — ингибитор трипсина, На фиг, 3 на оси ординат показаны единицы удельной протеолитической и ингибиторной активностей, а по оси абсцисс указан суточный возраст проростков и листьев: 1, 2 — одно — двухсуточные целые проростки; 4 — четырехсуточные листья, На фиг. 3 — даны следующие обозначения: 1— протеолитическая активность трипсина; 2— протеолитическая активность проростков и листьев; 3 — ингибирование активности трипсина ядерным ингибитором; 4 — ингибирование ядерной протеиназы ядерным ингибитором; А — протеолитическая активность; Б — ингибиторная активность, Исследование фракций, обладающих протеиназной и ингибиторной активностью, включает предварительную консервацию растительных тканей и выделение из них клеточных ядер в глицериновой среде, Табл, 1 показывает что структура клеточных ядер по содержанию генетического материала не нарушена; табл. 2 иллюстрирует увеличение процентного выхода удельной протеиназной активности; табл. 3 иллюстрирует полноту выделения ядерных фракций; табл, 4 иллюстрирует компонентный состав аффинновыделенных ядерных трипсиноподобных протеиназ и их ингибиторов.

Фиг. 1-2 иллюстрируют влияние ступенчатой последовательности экстракций ядерных фракций на выход трипсиноподобных протеиназ и их ингибиторов; на фиг, 3 иллюстрирует протеиназную и ингибиторную активность аффинновыделенных трипсиноподобных протеиназ и их ингибиторов

5 в сравнении с активностью трипсина.

Предложенный способ рекомендуется в исследовании молекулярно-генетических механизмов зндогенной регуляции организации генетических, морфогенетических

l0 программ развития организма на разных онтогенетических стадиях дифференцированного роста растений.

Формула изобретения

Способ получения ядерных фракций.

15 обладающих протеиназной и ингибирующей активностью, из проростков злаковых культур путем выделения клеточных ядер. очистки их раствором. содержащим .гритон

Х-100 и хлористый натрий, и оценки проте20 иназной активности, отличающийся тем, что с целью повышения выхода и активности целевого продукта. перед выделением клеточных ядер растительную ткань консервируют. а очистку ядер проводят по25 следовательно растворами. содержащими

0,5% тритона Х - 100 с возрастающими концентрациями 0,14 М, 0,35 M и 2.0 М хлористого натрия, далее раствором. содержащим 6 М гуанидин хлорид с 0,1 о), -ным /3-меркаптозта30 налом, затем 0,5 н. раствором гидроксида натрия и аффинной хроматографией на сефарозе 4В с иммобилизованным трипсином либо ингибитором трипсина.

1733471 л4й т

zzad

Ид10дОQ у

60+аст проросткоВ (gy h

+ggеиь

500-, - Q

7 2

Црд е пророст и

/ 2,уолиоптио

"..— —,, /7оЯурми /Ll драж.1 — г

ДЗ

1733471

А га н

„а

0 3

/ o ep и/ 0

Фиг. 2 ароростни листе

Фиг Л

Редактор М. Циткина

Заказ 1640 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 з

1 ф

1

> ип

Ъ

su

Составитель Э, Иванова

Техред М,Моргентал Корректор Т. Малец