Способ оценки физиологической активности лектина к сахарам

 

СПОСОБ ОЦЕНКИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕКТИНА К САХАРАМ

Использование: изобретение относится к области биохимии и может быть использовано при изучении физиологических и химических процессов в биологических системах, а также иммунодиагностике растений. Целью является повышение точности оценки. Сущность: поставленная цель достигается тем, что к лектину добавляют различные сахара-ингибиторы с последующей оценкой активности в реакции торможения гемагглютинации по бальной системе. При этом дополнительно устанавливают активность лектина в пробах без добавления сахаров-ингибиторов, далее подсчитывают разность сумм баллов между пробами. Чем больше величина разности, тем выше физиологическая активность лектина к сахару. 1 табл. i

СООЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК щ) С 01 N 33 53

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОПНРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4698420/14 (22) 05.06.89 (46) 07.05.92. Бюл. N - 17 (71) Полтавский сельскохозяйственный институт и Киевский государственный университет им. Т.Г.Шевченко (72) Е.Л,Голынская, С.В.Поспелов и В.Н.Самородов (53) 615.475 (088.8) (56) Луцик М.Д. и др. Лектины. — Вища школа. Изд-во при Львовском университете, 1981, 156. (57) СПОСОБ ОЦЕНКИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ

АКТИВНОСТИ ЛЕКТИНА К САХАРАМ (57) Использование: изобретение относится к области биохимии и может быть

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано при изучении физиологических и химических процессов в биологических .системах, а также иммунодиагностике растений.

Известен способ определения физиологической активности лектина путем добавления к нему различных сахаровингибиторов с последующей оценкой ак, тивности в реакции торможения гемаг- глютинации.

По известному способу реакцию торможения гемагглютинации лектина проводят следующим образом. Фиксированные объемы лектина (0,05 мл) с посто-. янным титром (1:4) помещают в лунки иммунологического планшета с полукруглым дном и смешивают с равными объе„,SU„„1732276

2 использовано при изучении физиологических и химических процессов в биологическИх системах, а также иммунодиагностике растений. Целью является повьппение точности оценки. Сущность: поставленная цель достигается тем, что к лектину добавляют различные сахара-ингибиторы с последующей оценкой активности в реакции торможения гемагглютинации по бальной системе.

При этом дополнительно устанавливают активность лектина в пробах без добавления сахаров-ингибиторов, далее подсчитывают разность сумм баллов между пробами. Чем больше величина разности, тем вьппе физиологическая активность лектина к сахару. 1 табл., мами углеводов в серии их последова- тельных разведений, начиная с 0,6 М концентрации каждого сахара. После

15-минутной инкубации при комнатной 4 температуре к смеси добавляют 0,05 мл (ф

2%-ной суспензии трижпы отмытых эритроцитов и выдерживают 60-120 мин при о о

t 25 С. Оценку реакции гемагглютинации производят по наибольшему разведению сахара, полностью подавляющему агглютинацию эритроцитов с участием данного лектина, исходя из расчета, что в первой лунке конечное содержание углевода в смеси составляет 0,2М..

При этом чем меньшая концентрация сахара полностью подавляет темагглютинацию, тем выше физиологическая активность лектина по отношению к нему.

Однако определение физиологической активности лектина ко известному спо-

173 собу в единицах концентрации углевода варьируе в широких пределах и не мо" жет служить надежным критерием оценки. Кроме того, в ряде случаев добавление сахаров-ингибиторов не приводит к полному подавлению гемагглютинирующей способности лектинов даже при высоких концентрациях углевода, что также снижает разрешающую способность примейяемой оценки.

Цель изобретения - повышение точности определения.

Поставленная цель достигается тем,. что дополнительно определяют актив- ность лектина в пробах без добавления сахаров-ингибитороз по балльной системе. От полученноГо значения вычитают сумму баллов реакции агглютинации с добавлением сахара-ингибитора. При этом чем больше величина pasности, тем вьппе физиологическая ак-. тивность лектнна к сахару.

Способ осуществляется следующим образом.

Фиксированные объемы препарата / лектина с постоянным титром (1:4) помещают в иммунологические планшеты с полукруглым дном и смешивают с равными объемами углеводов в серии их последовательности двухкратных разведений. Систему инкубируют 1 ч при комнатной температуре, после чего в каждую лунку вводят равный исходному объему лектина объем 2Х-ной суспензии трижды отмытых эритроцитов и оставляют от 60"120 мин при t - +25 С.

Аналогично проводят постановку реакции гемагглютинации с .исследуемым лектином без добавления сахара-ингибитора.

Оценку гемагглютинирующей способности лектинов, как взаимодействующих с сахарой, так и без нйх, ведут визуапьно по пятибалльной системег

3 балла - резко выраженная агглютниация. Эритроциты в виде тонкой пленки более или менее равномерно., распределяются по всему дну лунки, 2 балла - умеренная агглютинация.

Эритроциты расходятся по дну лунки на расстояние, превыпающее в диаметре 2 мм, образуя кольцо с резко выраженной зернистостью по краям, 1 балл - слабая агглютинация.Эритроциты расходятся по дну лунки на расстояние менее 2-х мм, образуя колечко или диск.

6 4

0,5 балла - минимальная агглютинация.

В центре совокупности эритроцитов, осевших на дно лунки, возникает не- большой просвет.

О баллов - отсутствие агглютинации. Эритроциты скапливаются в центре лунки. l0 Затем определяют интенсивность агглютинации исходного раствора лектина без добавления сахара ингибитора„ суммируя значения в баллах каждой лунки иммунологического планшета. В

15 случае, когда проба анализируется в восьми лунках, эта величина в зависимости от активности препарата лектина может достигать 24 баллов.

Далее вычисляют сумму баллов реакции гемагглютинации смеси лектин-сахар (действительная активность). Она .устанавливается при добавлении к лектину индивидуального сахара в восьми последовательных разведеннях.

После этого вычисляют разность сумм баллов между пробами, определяя таким образом физиологическую активность лектина. При этом чем больше, величина разности, тем вьппе она к саЗО хару.

Пример. Путем дробного этанольного фракционирования из .неопыленных пестиков длинно- и коротко-. столбчатой боем примулы выделены лек35 тины (фракция, выпадающая в садок при 76Х-ном насыщении этанолом по . объему) неизвестной углеводной специфичности. При помощи реакций ингибирования гемагглютинирующей способнос40 ти необходимо определить их физиологическую активность к шести сахарам: арабинозе, глюкозе, галактиту, галактозе, фруктозе.

Реакцию гемагглютинации проводили

45 в иммунологических планшетах, оценивая по ранее указанной балльной системе. По известному способу оценка осуществлялась по минимальному количеству сахара (в мИ), при котором

50 полностью подавляется реакция геМаг-. . глютинации.

Изучая физиологическую актив юость лектина, выделенного из длинностолбчатой формы примулы,.по известному у способу, нельзя сделать однозначного вывода об его активности к какому,либо одному сахару. Из шести сахаров

:одинаковое количество пяти подавляло

:гемагглютинирующую способность препа2276 на. прототипу.

Ь, По предлагаемому способу (в условных баллах) углеводы

По прототипу, (в м11 сахара) Активность без сахара-ингибитора.

Активность действитель ная с сахаром-ингибитором .

Физиологическая активность

Длинностолбчатая форма

4,5

16

11,5

Арабиноза

Глюкоза

Галактит

Ксилоза

Галактоэа

Фруктоэа

16

16

16

7 5

100

8,5

Короткостолбчатая форма

200

24

24

24

24

24

24 .

Арабиноэа

Глюкоза

Галактит

Ксилоза

Галактоэа

Фруктоэа

23

19,5

12 ° 5

12,5

14,5

9,5

5. 173 рата. При оценке предлагаемым способом удалось установить, что Hs шести углеводов наибольшая разность сумм баллов между пробами, а Значит, и фи-. зиологическая активность, выявлена лишь к арабиноэе. 3а ним в порядке убывания следуют галактоза, глюкоза, галактит, ксилоза и фруктоза.

У короткостолбчатой формы примулы при оценке по известному способу в наименьшей концентрации (12,5 мИ) подавляли активность лектина лишь два сахара — ксилоэа и галактоза. Не удалось установить физиологической активности лектина к глюкозе и галактиту.

Проведение оценки по предлагаемому способу показало, что данный.лектин проявляет наибольшую физиологическую активность к ксилозе (19,5 балла). У галактозы этот показатель 17 единиц.

Удалось также установить очень низкую активность препарата к галактиту, что нельзя было сделать при оценке по

Таким образом, предлагаемый способ. позволяет выявить разницу в физиологической активности в тех случаях, когда по прототипу такового не наблю дается, т.е. предлагаемый способ является более точным.

Результаты способа представлены в

- таблице.

Формула из обре т ения . Способ оценки физиологической активности лектина к сахарам путем добавления к исследуемой Пробе лектина разднчных сахаров — ингибиторов с последуюцей оценкой активности в реак, ции торможения гемагглютинации по сумме баллов, -о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точ»

20 ности способа, дополнительно устанавливают активность лектина в пробах без сахаров - ингибиторов, определяют физиологическую активность по разнос.ти между суммами баллов и по уровню

25 разности оценивают активность лекти