Способ концентрирования вируса марбург из суспензии

 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается концентрирования вирусосодержащих суспензий в вирусологической практике. Цель изобретения - повышение степени концентрирования вируса Марбург из суспензии с сохранением его биологической активности. Способ включает обработку суспензии вируса Марбург водорастворимым полимером с последующим отделением осадка, содержащего концентрат вируса. В качестве водорастворимого полимера используют природный полимер хитозан, который добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации5 10 - 1 10 2%. Хитозан применяют в виде водного раствора с исходной концентрацией до 2%. З.табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4832839/13. (22) 29.05.90 (46) 15.07,92. Бюл. ¹ 26 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнопроизводственного объединения "Вектор" (72) В.Н.Зеленков, В.В.Солодкий и С,К.Василенко (53) 576.8.094.29:576,858 (088.8) (56) Кузнецова. С.В„Передереев Н,И.. Кузнецов П.П., Игнатьева В.С, Очистка и концентрирование вируса бешенства полиэтиленгликолем. — Ветеринария, 1974, N 9, с.42. (54) СПОСОБ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ ВИРУСА МАРБУРГ ИЗ СУСПЕНЗИИ

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается концентрирования вируссодержащих суспензий в вирусологической практике.

Известен способ концентрирования вируса японского энцефалита путем обработки суспензии вируса сульфатом аммония.

Осаждение вируса производится за счет его высаливания солью. Концентрация сульфата аммония в суспензии вируса составляет

20-40%. Эксперименты показывают, что использование вышеуказанных концентраций сульфата аммония для осаждения вируса

Марбург приводит к концентрированию суспензии по объему от 10 до 40 раз при отсутствии эффекта концентрирования по биоактивности (биотитру) вследствие высокой инактивации вируса Марбург.

Недостатком этого способа является высокая инактивация вируса Марбург, японского энцефалита и других вирусов в про,, О, 1747485 À1 (57) Изобретение относится к медицинской промышленности и касается концентрирования вирусосодержащих суспензий в вирусологической практике. Цель изобретения— повышение степени концентрирования вируса Марбург из суспензии с сохранением его биологической активности. Способ включает обработку суспензии вируса Марбург водорастворимым полимером с последующим отделением осадка, содержащего концентрат вируса. В качестве водорастворимого полимера используют природный полимер хитозан, который добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 5 10 — 1 10 %. Хитозан применяют в виде водного раствора с исходной концентрацией до 2%. З.табл. цессе концентрирования сульфатом аммоний, а также высокое содержание осадителя (соли) в растворе, что требует последующего удаления соли из суспензии, Наиболее близким к предлагаемому является способ концентрирования вируса бешенства методом флокуляции, В качестве флокулянта используют водорастворимый неионогенный полимер полиэтиленгликоль . (ПЭГ с мол,массой 60000) в концентрации

1-9%. Экспериментальные исследования полиэтиленгликоля, используемого в качестве реагента для осаждения вируса Марбург, показали, что применение вышеуказанных концентраций ПЭГ для осаждения вируса Марбург позволяет увеличить концентрацию вируса не более чем в

13 раз по биотитру по сравнению с исходной концентрацией вируса.

Недостатком прототипа является инактивэция вирусов (Марбург, бешенства) в

1747485 процессе их осаждения полизтиленгликолем, а также довольно высокое содержание ПЭГ в растворе (до 9 ), что требует последующего его удаления иэ суспензии.

Целью изобретения является повышение степени концентрирования вируса Марбург с сохранением его биологической активности.

Цель достигается тем, что согласно способу суспензию вируса обрабатывают водорастаорймым полимером с последующим отделеййейЪсадка, содержащего концент.Ф .„ .„ ф, рат вируса. а,„качестве водорастворимого полимера используют природный полимер хитозан, который добавляют в вируссодержащую суспензию в виде водного 1,5-2 ного раствора до конечной концентрации 5

10 — 1 10, Способ реализован следующим образом.

Суспензию вируса Марбург, полученную стандартным способом культивирования на клетках ЛЭЧ (легкие эмбриона человека), разливают по 50 мл в 6 центрифужных пробирок. Водный раствор хитозана с начальной концентрацией 1,5-2,0 добавляют в вируссодержащую суспензию до получения конечной его концентрации 5

10 — 1 10, Операцию введения аликвот раствора хитозана проводят при комнатной температуре и постоянном перемешивании, Суспензию отстаивают при 4 С(температура бытового холодильника) в течение

48 ч. После отстаивания надосадочную жидкость сливают, а осадок ресуспендируют, Определение биоактивности ресуспендированного осадка проводят стандартным методом титрования на монослое клеток чего, Биоактивность выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 1 мл суспензии.

Примеры выполнения способа при различных концентрациях хитозана приведены в табл.1, Анализ табл.1 показывает, что использование хитозана с конечной концентрацией в суспензии менее 5 10 (пример 2)

-з обеспечивает незначительное концентрирование вируса Марбург (в 4 раза) при пол. ноте осаждения около 6 . Увеличение

:онцентрации хитозана в вигруссодержащей суспензии более 1.10 (пример

5) приводит к увеличению объ.ема осадка при отстаивании, за счет чего значительно снижается степень концентрирования вируса по объему и по титру.

Формула изобретения

Способ концентрирования вируса Марбург из суспенэии, включающий ее обработку водорастворимым полимером с последующим отделением вирусного осадка, от л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения степени концентрирования вируса с сохранением его биологической ак55

В примерах 2 — 6 наблюдается полное сохранение биоактивности вируса Марбург, Введение раствора хитозана в конечных концентрациях 5х10 -1х10 в суспен-з -г, 5 зию позволяетсконцентрировать виол более чем в 10 раз по титру. Для концентрирования используют растворы хитозана, имеющие начальную концентрацию до 2 мас. .

Применние больших концентраций хитоза10 на(свыше 2 ) нецелесообразно из-за повы:. шения его вязкости, что технологически затрудняет работу с этим реагентом, При- чем использование растворов хитозана с начальной концентрацией до 2 позволяет

15 вводить его в малых объемах в суспензию вируса. Так, что проведения концентрирования объем вводимого раствора хитозана не превышает 0 5 от объема концентрируемой суспензии вируса.

20 Экспериментальные данные по хранению концентрата вируса Марбург, полученного предлагаемым способом, при 4 С (температура бытового холодильника) приведены в табл.2, что свидетельствует о со25 хранении его биологической активности в течение двух недель.

Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа по сравнению с прототипом состоит в следующем. Э ксперимен30 тальные исследования водного раствора полиэтиленгликоля (прототип) с конечной концентрацией в суспензии 1 — 9 для осаждения вируса Марбург показали, что концентрацию вируса можно увеличить не

35 более чем в 13 раз по биотитру по сравнению с исходной его концентрацией.

B табл.3 приведены данные по концен-. трированию суспензии вируса Марбург с использованием полиэтиленгликоля.

40 Преимуществом предлагаемого способа концентрирования вируса Марбург (табл,1) по сравнению со способом-прототипом (табл,3) является повышение степени концентрирования вируса в 3 и более раз с

45 сохранением его биологической активности. При этом концентрация осадителя в предлагаемом способе ниже, чем в прототипе на два порядка, вследствие чего не требуется дополнительная очистка вируса от

50 осадителя.

1747485 тивности, к вируссодержащей суспензии добавляют водный 1,5-2,0 -ный раствор природного полимеоа хитозана до конечной концентрации 5 10 — 110

Объем суспензии,мл

Пример

Начальная

Конечная

Степень концентрирН суспензии

Объем осадка, мл

Полнота концентрация хитозана,? концентрация хито зана в осаждения вируса,Ф по объему по титру суспензии, 7,2

62,5 4,0

1 10 з 0,8 7,2

1,8

6,3

1,6 7,2

1,8

79,4

313 12 6

16,7 20,0

2,6 3,2

5 10

1,8

1.10 30 72

99,0

1,8

20,0 7,2

30,0 7,2

5 ° 10

1 ° 10

99,0

1,8

1,7 2,0

99,0

Таблица 2

Таблица 3

Составитель Ю.Мистюрин

Редактор Т.Лазаренко Техред M,Ìoðãåíòàë Корректор M,Äåì÷èê

Заказ 2473 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

1 50

2 50

3 50

4 . 50

5 50

* Контроль — нативная суспензия вируса Марбург.

Титр концентрации вируса, БОЕ/мл

6,1+0,2

6,740,1

7,2 0,2

7,4ь0,1

6,620,1

6,4 0,1

Таблица! рования, х крат