Способ концентрирования суспензии вируса марбург

 

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается концентрирования вируссодержащих суспензий в вирусологической практике. Цель изобретения - повышение степени концентрирования вируса Марбург из суспензии с сохранением его биологической активности. Способ включает обработку суспензии химическим реагентом с последующим отделением осадка, содержащего концентрат вируса. В качестве химического реагента используют водный раствор полиэтиленимина, который добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 1-10 - 2,0-КГ %.3табл.

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5Ц5 С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕННЫ И КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Д 11 и И аМ%Ж (, ащщ

I л

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4832840/13 (22) 29.05.90 (46) 15.07.92, Бюл. ¹ 26 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнопроизводственного объединения "Вектор" (72) B.Í.ÇåëåíêîB и В,В,Солодкий (53) 576.8,094.29;576.858 (088.8) (56) Кузнецова С.В., Передеряев H.È., Кузнецов П,П., Игнатьева B.Ñ. Очистка и концентрирование вируса бешенства полиэтиленгликолем. — Ветеринария, 1974. № 9, с.42. (54) СПОСОБ КОНЦЕНТРИРОВАНИЯ СУСПЕНЗИИ ВИРУСА МАРБУРГ

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается концентрирования вируссодержащих суспензий в вирусологической практике.

Для концентрирования различных вируссодержащих суспензий широко используются химические и физико-химические методы, К таким методам относятся методы осаждения вирусов из суспензий солями, водорастворимыми полимерами (полиэтиленгликолем), а также бифазными полимерсодержащими системами.

Известен способ концентрирования вируса японского энцефалита путем обработки суспензии вируса сульфатом аммония, Осаждение вируса производится за счет его высаливания солью. Концентрация сульфата аммония в суспензии вируса составляет

20-40%. Эксперименты. показывают, что использование вышеуказанных концентраций сульфата аммония для осаждения вируса

Марбург приводит к концентрированию суспензии по объему от 10 до 40 раз при отсут,,QJ,, 1747486 А1 (57) Изобретение относится к медицинской промышленности и касается концентрирования вируссодержащих суспензий в вирусологической практике. Цель изобретения— повышение степени концентрирования вируса Марбург из суспензии с сохранением

его биологической активности. Способ включает обработку суспензии химическим реагентом с последующим отделением осадка, содержащего концентрат вируса. В качестве химического реагента используют водный раствор полиэтиленимина, который добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 1 ° 10 — 2,0 ° 10

%. 3 табл, ствии эффекта концентрирования по биоактивности (биотитру) вследствие высокой инактивации вируса Марбург.

Недостатком этого способа является высокая инактивация вируса Марбург, японетй ского энцефалита и других вирусов в процессе концентрирования сульфатом аммония, а также высокое содержание оса- Ь дителя (соли) в растворе, что требует после- Д дующего удаления соли из.суспензии. ф

Наиболее близким к предлагаемому яв- QQ ляется способ концентрирования вируса бе О, шенства методом флокуляции. В качестве флокулянта используют водорастворимый неионогенный полимер полиэтиленгликоль (ПЭГ с мол,массой 60000) в концентрации

1-9%, Экспериментальные исследования полиэтиленгликоля, используемого в качестве реагента для осаждения вируса Марбург, показали, что применение вышеуказанных концентраций ПЭГ для осаждения вируса Марбург позволяет увеличить концентрацию вируса не более чем в

1747486

13 раз по биотитру по сравнению с исходной концентрацией вируса..

Недостатком прототипа является инактивация вирусов (Марбург, бешенства) в процессе их осаждения полиэтиленгликолем, а также довольно высокое содержание

ПЭ Г в растворе (до 97;, что требует последу"ющего его удаления из суспензии.

Целью изобретения является повышение степени концентрирования вируса Марбург с сохранением его биологической актйвностй."

Цель достигается тем, что согласно способу проводят обработку суспензии вируса водорастворимым полимером с последующим отделением осадка, содержащего концентрат вируса, В качестве водорастворимого полимера используют раствор полиэтиленимина, который добавл я ют в ви руссодержащую счспейзи ю до конечной концентрации 1 10 — 2,0 10 g,.

Способ реализуют следующим образом.

Суспензию вируса Марбург, полученную стандартным способом культивирования на клетках ЛЭЧ (легкие эмбрионы человека), разливают rio 40 мл в 6 центрифужных пробирок. Водный раствор полиэтиленимина с мол,массой 60000 и концентрацией 10-20-",ь добавляют в вируссодержащую суспензию до получения конечной его концентрации 1-10 — 2.0 10 7,.

Операцию введения аликвот полиэтиленимина проводят при комнатной температуре и перемешивании, Суспензию отстаивают не менее 24 ч при 4 С(температура бытового холодильника). После отстаивания надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 1,2 мл раствора Хенкса или другую стандартную среду и ресуспендируют.

В зависимости от соотношения обьемов исходной вирусной суспензии и среды для ресуспендирования получают продукт нужной кратности концентрирования. Определение биоактивности ресуспендированного осадка проводят стандартным методом титрования на монослое клеток чего.

Биоактивность выражают в бляшкообразу:ющих единицах (БОЕ) на 1 мл суспензии, Способ может быть использован в лабораторных условиях для повышения:концентоации по биотитру вируса Марбург, а также в вирусологической практике для получения антигена указанного вируса из его культуральных суспензий низких концентраций, Конкретные примеры выполнения способа при различных концентрациях полизтиленимина приведены s табл.1.

Анализ табл.1 показывает, что исполь зование водного раствора полиэтиленимина в диапазоне конечных концентраций 1,0 х10 — 2,0 10 позволяет сконцентрировать вирус Марбург более чем в 10 раэ по титру при сохранении его биоактивности и

5 полноте осаждения вируса 40-98;4. Начальные концентрации раствора полиэтиленимина сущесТвенного влияния на процесс концентрирования не оказывают, Использование конечных концентраций полиэти10 ленимина менее 1,0 ° 10 7 . ведет к снижению полноты осаждения вируса и степени его концентрирования,. Увеличение концентрации полиэтиленимина более 2,0х

40 $ ведет к значительной инактивации ви15 руса, снижению полноты осаждения и степени концентрирования по титру. Кроме того, экспериментальные данные по хранению концентрата вируса Марбург, полученного вышеописанным способом, при 4 С

20 (температура бытового холодильника) свидетельствует о сохранении его биологической активности в течение 1 мес.

Данные по хранению концентрата вируса Марбург, полученного с использованием

25 полиэтиленимина приведены в табл.2, .

Экспериментальные исследования водного раствора полизтиленгликоля (прототип) в конечной концентрации в суспензии

30 1-9;, для осаждения вируса Марбург показали (табл,3), что концентрацию вируса можно увеличить не более чем в 13 раз по биотитру по сравнению с исходной его концентрацией.

35 Данные-по концентрированию суспензии вируса Марбург с использованием полиэтиленгликоля приведены в табл.З.

Преимуществом предлагаемого способа концентрирования вируса Марбург

40 (табл.1) по сравнению со способом-прототипом (табл.2) является повышение степени концентрирования вируса в три и более раз с сохранением его биологической активности, При этом концентрация осадителя в

45 предлагаемом способе ниже, чем в прототипе на два порядка, вследствие чего не требуется дополнительная очистка от осадителя;

Формула изобретения

50 Способ концентрирования суспензии вируса Марбург, включающий ее обработку водорастворимым полимером с последующим отделением вирусного осадка, отличающийся тем, что, с целью повышения

55 степени концентрирования вируса с сохранением его биологической активности, к вируссодержащей суспензии добавляют

10-20%-ный водный раствор полиэтиленимина до конечной концентрации 1. 10

-з

2,10-2о

1747486

Таблица!

Начальная

При- Обьем

Конечная

Титр концентрата вируса, БОЕ/мл

Полнота осаждения вируса,Ф

Степень конконцентра" ция поли суспензии>мл мер центрирования по титту, х крат. этиленимина

\ в суспензии, 40 Контроль (без обработки реагентом) 15,5

5,0

20,0

5,0.10 100

8,0

84,0

1,0.10 з 100

19,5

5,0 10

5,0 1.0 з

1,0 10 32,0

25,0

25,0

16,0

5

19,5

15,5

19,5

97,0

90,0

100 !

100

40,0

7 40

8 40

9 40

19,5

2,0 ° 10 2

1,0 10-2

1,0 10

40,0

40,0

30,0

40,0

19,5

3,0

15,5

40,0

Контроль (без обработки реагентом) 40 О

10 .1

11 1

7., 1+0,2

95,0

19,5

5 10

1,0 ° 10 2

100

19,5

98,0

100

7,0+0,2

32,0

Таблица2

Таблица 3

Составитель Ю.Мист!орин

Редактор Т.Лазаренко Техред М.Моргентал Корректор М,Ткач

Заказ 2473 . Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 концентра" ция полиэтиленймиГ на в суспензии, Ф

Сохранение биоактивности ви руса при концентрировании,4

60 0,!

П,2

6,7 0,1

0,1

7,3 0,2

7,5+О,

7,4+0,1

7,4+0,1

0,1

7,2+,, >

6,4 0,1

6,4+0, 1

5,0 0,2