Способ определения мембранотропности ксенобиотиков

 

Использование: медицина, в частности фармакология и биотехнология, и может быть использовано в скрининге мембранотропных препаратов. Цель: ускорение и повышение чувствительности способа определения мембранотропности ксенобиотиков . Сущность изобретения: определяют активность мембранного фермента, например глюкозо-6-фосфатазы. в системе In vitro, для чего выделяют микросомы печени животных и инкубируют их в растворе на основе сахарозы при 20-26°С в течение 20- 60 мин в присутствии испытуемого ксенобиотика . 3 ил., 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕ СКИХ

РЕСПУБЛИК (st>s G 01 и 33/68

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

k (21) 4759453/14 (22) 20.11.89 (46} 23.07.92. Бюл. ЬЬ 27 (71) Харьковский государственный университет им. А.M.Ãîðüêîãî (72) А.И. Божков и В.Л.Длубовская (56) Хакимов 3.3. Воросы мед, химии. 1985, т. 31, с, 80-82. (54)СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕМ6РАНОТРОПНОСТИ КСЕНОБИОТИКОВ (57) Использование: медицина, в частности фармакология и биотехнология, и может

° Изобретение относится к медицине, к области фармакологии и биотехнологии и может быть использовано при скрининге мембранотропных препаратов, а также в исследовании молекулярных механизмов адаптации мембранной системы клетки в ответ на действие разнообразных веществ.

Цель изобретения — ускорение и повышение чувствительности способа оценки мембранотропности ксенобиотиков.

На фиг. 1 приведены результаты активности глюкозо-6-фосфатазы в контроле(кривая f) и внесении в среду препарата амниоцен (кривая 2) при различных температурах инкубации; на фиг. 2 — кривые изменению активности глюкоэо-6-фосфатаэы в контроле (кривая 3) и при внесении препарата амниоцен (кривая 4) в зависимости от времени инкубации; на фиг. 3 — кривые изменения активности глюкозо-6-фосфатаэы контрольных микросом(кривая 5) и при внесении препарата амниноцен (кривая 6). при инкубации их в 0,25 М сахарозе (а) и буферной системе (б). Ы, 1749835 А1 быть использовано в скрининге мембранотропных препаратов. Цель: ускорение и повышение чувствительности способа определения мембранотропности ксенобиотиков. Сущность изобретения: определяют активность мембранного фермента, например глюкозо-б-фосфатаэы, в системе In

vitro, для чего выделяют микросомы печени животных и инкубируют six в растворе на основе сахарозы при 20-26 С в течение 2060 мин в присутствйи испытуемого ксенобиотика. 3 ил., 2 табл, Способ осуществляется следующим образом.

Крыс линии Вистар, самцы двухмесячного возраста, голодающих 12 ч перед забоем, декапитируют. Печень перфузируют охлажденной до 2-4 С 0,25 М сахарозой, после чего ее продавливают через ручной пресс или тщательно измельчают ножницами. Полученный материал гомогенизируют в 0,25 М охлажденной сахарозе (2-4 С) в соотношении 1 т ткани к 4 мл укаэанного раствора в стеклянном гомогениэаторе с тефлоновым пестиком (8 тракций, 1500 об! мин} при постоянном охлаждении. Гомогенат фильтруют через 4 слоя марли и центрифугируют его при 1000 g в течение 10 мин . при 2-4 С. Надосадочную жидкость центрифугируют при 11000 g в течение 15 мин при

2-4ОС, Полученный таким образом супернатант цинтрифугируют при f05000g в течение

60 мин при 2-4 С, Осадок микросом суспендируем в 0,25 M сахарозе, содержащей буфер или же без него (в ручном

1749835 гомогениэаторе) до получения однородной суспенэии. Определяют содержание белка в суспензии и разводят суспензию тем же раствором так, чтобы в 0,1 мл суспенэии содержалось 800 мкг белка. Полученную 5 суспензию разливают в пробирки по 1 мл и вносят по 20, 50, 100 мкл раствора испытуемого препарата. Образцы инкубируют при

4,16 и 260С в течение 20 мин или 60 м при постоянном перемешивании системы, По 10 истечении времени инкубации в образцах определяютактивность глюкоэо-6-фосфатазы одним из известных способов.

Результаты влияния препарата амйиоцен на активность глюкоэо-6-фосфатазы в 15 системах in vivo и! и vitro приведены в табл.

1, Из данных, представленных в табл. 1 следует, что в случае (0,6 мл препарата на

100 г массы тела) известного ингибируется 20 активность фермента через 24 ч после введения животным препарата на 240, доза

0,9 мл препарата оказывает такое же действие на активность фермента. В предлагаемом способе внесение 0,05 мл преперата на 25

1 мг белка микросом вызывает угнетение активности фермента на 70Я, по сравнению с контролем уже через 20 мин. Увеличение дозы препарата в 2 раза увеличивает угнетение активности в 1,3 раза, т,е. на 90 (, по 30 сравнению с контролем (табл, 2), Инкубация микросом с препаратом амниоцен в дозе 20 мкл на 0,1 мл суспензии микросом, содержащей 800 мкг белка,. при 35

160С не вызываем статически достоверного уменьшения активности глюкоза-6-фосфатазы. Увеличение температуры инкубации до 19 С приводит к некоторому увеличению разницы в активности фермента между кон- 40 тролем и опытом по сравнению с 16 C. При температуре 20-26 С наблюдается наибольшая разница между активностью фермента контрольного и опытного варианта.

Эта разница сохраняется и при 27 С, одна- 45 ко при этой температуре наблюдается снижение активности фермента в контрольном варианте, что может указывать на конформационные изменения мембран при этой температуре (фиг. 1).. 50

Таким образом, оптимальной температурой инкубации микросом в системе in

vitro при иСпытании ксенобиотиков на мем,боанотропность является температура 2026ОС. 55

Что касается временных интервалов инкубации, то увеличение времени ийкубации микросом до 80 мин в среде с 0,25 М саха-. розой приводит к снижению активности глюкозо-6-фосфатазы по сравнению с 1060-минутной инкубацией (фиг. 2). Учитывая, что исследуемый фермент является интегральным белком микросом и даже небольшие конформационные изменения мембран сказываются на активности глюкозо-6-фосфатазы, можно полагать, что инкубация микросом при 26 С в течение 80 мин приводит к конформационным изменениям структуры микросом, которые могут приводить к потере биоспецифичности их взаимодействия с ксенобиотиками. Подтверждением этому может служить резкое падение активности глюкоэо-6-фосфатазы при 80-минутной инкубации с препаратом амниоцен (фиг. 2). С . этой точки зрения максимальное время инкубации не целесообразно увеличивать более 60 мин.

Минимальное время инкубации определено в 20 мин потому, что при 10-15-минутных экспозициях угнетение активности фермента препаратом незначительно, а начиная с 20 мин обнаруживается достоверная разница между контролем и опытом (фиг. 2), Таким образом, инкубация испытуемых препаратор от 20 до 60 мин в системах выделенных мембран является оптимальной при определении мембранотропность ксенобиотиков, При выборе состава среды инкубации руководствуются следующим; при суспендировании микросом в среде с буфером трис-HCI, рН 7,6, содержащем 0,05 M KCI u

0,005 М М9С!2 дольше сохраняется активность фермента, что указывает на стабилизацию их структуры. Однако внесение препарата в систему с микросом на основе сахарозы и буфера показало, что уменьшение активности глюкозо-6-фосфатаэы наблюдается в большей степени в микросомах суспендированных в 0,25 М сахарозе (фиг.

3). Очевидно стабилизация структуры мембран, вызванная составом среды инкубации, снижает чувствительность мембран к действию ксенобиотиков, На основании полученных результатов можно заключить,.что микросомы суспендированныв в 0,25 M сахарозе обладают большей чувствительностью, чем в среде с буфером.

8 предлагаемом способе о мембранотропности ксенобиотиков судят по уменъшенйю актйвности глюкозо-6-фосфатазы.

Формула изобретения

Способ определения мембранотропности ксенобиотиков путем исследования изменений в клетках печени .крыс, подвергшихся воздействию ксенобиотика, отличающийся тем. что. с целью ускорения и повышения чувствительности способа, в качестве биологического матери1749835

20-60 мин и при изменении активности фермента в сравнении с контролем делают вывод о мембранотропности ксенобиотика. ала используют препарат микросом печени, определяют в нем активность глюкозо-6фосфотазы, при этом инкубируют препарат в растворе сахарозы при 20-26 С в течение

Таблица 1

Таблица 2

I2 I2

?б I9

I2 12

20 24

Nvz. r

4 о о C4 м

I 2

28 теиперат. ййКуб ацйи

1749835

°,У о

5С

8С

Редактор М.Бланар

Заказ 2593 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-36, Раушская нэб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

° Е о

А м .3

М

М

5 б 5 6

Составитель И.Митюшин

Техред М.Моргентал Корректор М.Шароши