Штамм клеток рабдомиосаркомы крыс ра-22, используемый для выявления особенностей опухолей, устойчивых к лечению гипертермией

 

Использование: медицина, экспериментальная онкология, Сущность изобретения: получен в процессе многоступенчатой селекции (78 циклов отбора) на устойчивость к термальным воздействиям клеток штамма рабдомиосаркомы РА-21, полученного на основе штамма рабдомиосаркомы аффинитетной РА-2. Штамм пассируется на белых беспородных крысах путем внутривенного введения суспензии одиночных клеток через каждые 20 дней. Штамм обладает высокой термоустойчивостью и радиоустойчивостью, является удобной моделью для изучения процесса метастазирования и испытания химиотерапевтических препаратов для опухолей с повышенной термои радиоустойчивостью, не чувствительных к лечению гипертермией и радиотерапией . 2 ил,

,, . Ы,, 1751201 A l

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Изобретение -относится к медицине и (рабдомиосаркомы), штаммы получены не в может быть использовано в эксперимен- результатедлигельйбйселекцйи,алишьпо-. тальной онкологии для изучения процессов сле 10-15 циклов отбора. характеризуются метастазирования терморезистентных опу- - низкой колониеобразующей способностью холей, а также для скрининга химиотерапев- и не обладают устойчивостью к термальным тических препаратов, подавляющих рост и .. воздействиям. метастазирование опухолей человека, yc-. Наиболее близкимкизобретениюявля. тойчивых к термотерапии.. ется штамм рабдомиосаркомы PA-2 крыс, Известны штаммы опухолевыхклетокмы- полученный в Институте цитологии АН шей, характеризующиеся высокой сте- СССР путем многоступенчатого отбора на пенью злокачественности и органо1ропным аффинитет к легочной ткани, Штамм харакметастазированием: меланома В16иееcy6- теризуется высоким метэстатическим поштаммы, КСМЛ (штамм кэрциономы, мета- тенциэлом. более высокой по"сравнению с стазирующей в легкйе), BMP (штамм аналогами; колониеобразующей способновысокометастазирующего рака) и его суб- стью (K0E = 0,013 0,006) и аффинитетом к штаммы, ЛМТ (лимфогенно метастазирую-": легочной ткани (метастазы в другие органы щая тератокарционома), Однако частота не обнаружены), околотетраплоидным cîметастазирования этих штаммов и 0pll àé0»- держанием ДНК(ДИ=1,97-2;04). тропностьметэстазированиянизки,частота Однако клетки штамма РА-2 чувствиметастазирования в другие органы более тельны ктермальномувоздействию43,44и

15%, не известен штамм клеток, получен- 45 С Qp = 1,6 Гр) и недостаточно высокой ный на основе опухоли скелетных мышц колониеобразующей способностью., 1 (21) 4845902 13 (22) 07.06,90 (46) 30.07.92. Бюл. ¹ 28 (71) Институт цитологии АН СССР (72) Е,В,Федорова, В.Д.Трусова, Ю.Б.Вахтин, Е.В.Камийская и И,В,Гужова . (56) Степаньян Л,И.. Вахтий Ю.В. Цитология, 1980, т, 22, N 2, с. 198-204. . (54) ШТАММ КЛЕТОК РАБДОМИОСАРКОМЫ КРЫС РА-22, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ

ВЫЯВЛЕНИЯ ОСОБЕНЙОСТЕЙ ОПУХОЛЕЙ, УСТОЙЧИВЫХ К ЛЕЧЕНИЮ ГИПЕРТЕРМИЕЙ (57) Использование: медицина, экспериментальная онкология, Сущность изобретения: получен в процессе многоступенчатой се2, лекции (78 циклов отбора) на устойчивость к термэльным воздействиям клеток штамма рабдомиосаркомы PA-21, полученного на основе штамма рабдомиосаркомы аффинитетной PA-2, Штамм пассируется нэ белых беспородных крысах путем внутривеййого введения суспензии одиночных клеток через каждые 20 дней. Штамм обладает высокой термоустойчи вость ю и радиоустойчивостью, является удобной моделью для иэученйя процесса метастазирования и испытания химиотерапевтических препаратов для опухолей с повышенной термо- и радиоустойчивостью; не чувствительных к лечению гйпертермией и радиотерапией. 2 ил, 1751201 .

Целью изобретения является получение штамма рабдомиосаркомы крыс с наследственно повышенной термоустойчивостью клеток.

Данный штамм РА-22 получен в процессе многоступенчатой селекции (78 циклов отбора) на устойчивость к термальным воздействиям на основе штамма клеток рабдомиосаркомы PA-21, который получен в процессе селекции (200 циклов отбора) штамма РА-2.

Селекцию штамма РА-22 проводили в условиях ln чЬо при помощи внутривенных перевивок суспенэий одиночных опухолевых клеток, подвергавшихся термальному воздействию ин витра, белым беспородным крысам через каждые 20 дней. Суспензии одиночных опухолевых клеток получали из опухолевой ткани, взятой от 20-30 легочных метастазов, с использованием ростовой среды Игла. Нагревание суспензии проводили на водяной бане в термостате (точность нагрева +0.1 С), после нагрева клетки выдерживали 1 ч при комнатной температуре и вводили внутривенно животным, Доза вводимых опухолевых клеток — 200000 клеток на одно животное, Штамм хранится в

Банке перевивных штаммов ВОНЦ АМН

СССР, регистрационный М 13-9-3, Особенности культивирования штамма в условиях In чего.

Штамм культивировали на ростовой среде Игла с добавлением 10 сыворотки эмбриона коровы, 2 м М глутамина, 200 ед/мл пенициллина и 0,0004 гlмл стрептомицина, Культивйрование проводили при 37" С втерметических флаконах в термостате без подачи COz. Кратность рассева 1:3 йри пересеве через .72 ч, Посевная доза клеток — 200000 на мл. Криоконсервацию проводили в сыворотке эмбрионов коровы с добавлением 10 диметилсульфоксида при концентрации 1х10 клеток/мл. Жизнеспособность клеток после размораживания 8590%.

Ростовые характеристики штамма.

Прививаемость животным при внутривенных иньекриях 10000 клеток/жйвотное

100, при подкожном введении суспензии опухолевых клеток в дозе 50000 клеток/животное 100, аффинитет к легочной ткани (экспериментальные метастазы формируются только в легких) 100%, колониеобразующая способность (КОЕ) 0,16"-0,008, Морфологические характеристики штамма.

Штамм представляет собой низкодифференцированную веретеноклеточную рэбдомиосаркому. Основные клеточные элементы веретеновидные (12 — 25 мкм) и округлые 9 — 15 мкм клетки . Штамм характеризуется околотетраплоидным содержанием

ДНК (диплоидный индекс 1,86 — 1,91). Карио5 логически штамм характеризуется 21 парой хромосом, большое число мета- и субметацентриков.

Особенностью штамма является высокая термоустойчивость клеток, Значения Д0, 10 вычисленные по кривым выживаемости клеток после нагрева, равны при термальной обработке 43 С 9,8 мин, при термальной обработке 44 С 12,5 мин, при термэльной обработке 45 С 13,5 мин.

15 Особенностью штамма также является высокая радиоустойчивость клеток. Значение До, определенное по кривой выживаемости клеток после их облучения в диапазоне доз 1-10 Гр, равно 2,4 Гр.

20 Пример 1. Для изучения динамики утраты термоустойчивыми опухолевыми клетками способности метастазировать после их нагревания при 45 С в течение 10, 20 и 30 мин суспензию одиночных опухолевых

25 клеток (концентрация клеток 1 млн/мл) в среде Игла помещали на водяную баню в термостат (точность нагрева + 0,1 С) при

45 С на 10, 20 и 30 мин, после нагрева клетки выдерживали 1 ч при комнатной темпе30 рэтуре и вводили внутривенно каждую пробу 10 белым беспороднь!м крысам (доза введения — 200000 клеток на животное), Через 21 день животных забивали и проводили подсчет экспериментальных метастэ35 зов в легочной ткани. На основании полученных результатов строили кривые выживаемости клеток (фиг, 1), Полученная кривая доза-эффект показывает, что в пределах термальных воздей40 ствий 1 — 5 мин подвергнутые нагреванию опухолевые клетки репарируют термальные повреждения. Эффективное подавление способности опухолевых клеток к метастазированию начинается с 5 мин термэльного

45 воздействия. Нарастание утраты способности формировать экспериментальные метастазы характеризуется в данном примере значением До (До = 13,5 мин). Таким образом, штамм позволяет выявить динамику ут50 раты термоустойчивыми опухолевыми клетками способности формировать экспериментальные метастазы при определенном режиме нагревания и прогнозировать

55 результаты термального воздействия различной продолжительности, Пример 2. Для изучения комбинированного действия нагревания и различных режимов облучения нэ термоустойчивые опухолевые клетки суспензию одиночных опухолевых клеток PA-22 (концентрация

1751201 клеток —.1 млн/мл) в среде Игла помещали на водяную баню в термостат, точность нагрева 0,1ОС (при 44 С на 20 мин). после нагрева клетки выдерживали 5 — 10 мин при комнатной температуре и облучали в диапазоне доз 1-10 Гр на рентгеновском аппарате РУФ-1, фильтр 1,0 Си, 257 р/мин, вводили внутривенно каждую пробу 10 белым беспородным крысам (доза введения

10000-400000 клеток на крысу), Через 21 день животных забивали и проводили подсчет экспериментальных метастазов в ле. гочной ткани; На основании полученных результатов строили кривую выживаемости клеток (фиг, 2). Полученная кривая доза-эффект показывает, что эффективное подавление их нагревания при 44 С в течение 20 мин. и последующего облучения начинается с дозы облучения 2 Гр и нарастает по мере увеличения дозы облучения (2 — 10 Гр). Полученная кривая доза-эффект позволяет прогнозировать результаты комбинированного воздействия разных режимов облучения и . нагревания для клеток термоустойчивых .опухолей, Пример 3. Для скрининга химиотерапевтических препаратов, подавляющих рост и метастазирование опухолей челове. ка, устойчивых к термотерапии. суспейзию одиночных опухолевых клеток термоустойчивого штамма PA-22 концентрация клеток

100000/мл в среде Игла вводили внутривенно каждую пробу белым беспородным крысам (0,2 мл на животное): 10 животных — на каждый вариант опыта и 10 животных — на контроль. Через разные сроки после внутривенной перевивки (5, 10 и 14 сут) внутри. брюшинно вводили сарколизин в дозах 10, 20 и 30 мг/кг и через 21 сут после внутривенной перевивки животных контрольной и опытной групп забивали, извлекали легкие, вылущивали клоны, подсчитывали их количество и взвешивали на торзионных весах, и затем определяли количество колониеобразующих единиц (K0E) и торможение роста опухоли по общепринятым методикам.

Сарколизин, введенный вуказанныхдозах, оказывает заметное влияние на динамику изменения массы клонов и на количество клонов в легких, однако терапевтический эффект в значительной степени зависит от дозы препарата и режима его введения. Процент торможения роста опухоли в опыте при использовании показателя ("средняя масса клонов") изменялся от 7,7 до 73,4 . при использовании показателя

"количество клонов на легкое" —.от 16,2 до

96,37, при использовании показателя "масса опухолевой ткани на одно легкое" от 51,5 до 96,2 . Наблюдающиеся в опытах изменения клонов по количеству и массе позвогетерогенности популяции клеток термоустойчивых опухолей по чувствительности к сарколизину и определить, что значительную часть популяции -составляют клоны, способные репопулировать после терапев15 тического воздействия, Таким образом, использов.ание термоустойчивого штамма

PA-22 позволяет более дифференцированно изучать закономерности влияния химиотерапевтических препаратов на опухоли, ус20 тойчивые к термотерапии. выявлять особенности и динамику этих воздействий, Таким образом, предлагаемый штамм, как было уСтановлено в экспериментах, по25 ставленных с 10 по 60 пассаж селекции обладает более высокой колониеобразующей способностью (КОЕ = 0.16+0.08) по сравнению с прототипом — термочувствительным штаммом (КОЕ = 0,13+0,006). Дан30 ный штамм обладает почти в 3 раза более высокой термоустойчивостью (До = 13,5 мин), чем прототип — термочувствительный штамм (До = 4,1 мин). Радиоустойчивость заявляемого штамма (Д = 2,4 Гр) примерно в 1,5 раза больше. чем радиоустойчивость штамма — прототипа (До = 1,6 Гр).

Из этого следует, что предлагаемый штамм является удобной моделью для изу35 чения процесса метастазирования и испытания химиотерапевтических препаратов для опухолей с повышенной термоустойчивостью и радиоустойчивостью, и поэтому не чувствительных к лечению гипертермией и радиотерапией.

Формула изобретения

Штамм культивируемых клеток рабдомиосаркомы крыс PA-22 М 13-9-3 (Банк опухолевых штаммов ВОНЦ АМН СССР), используемый для выявления особенностей опухолей, устойчивых к лечению гипертермией.

10 ляют выявить высокую степень

1751201

4 1 ЧКЦИ я нцж вжих клеток

10»

1 ,"Ю-, 20. 30 ЧО ми

I !

Фракция выживших кяеток

2 3 Ч 5 б 7 8. 9.10::::::.Гр..:."". . .::::::::1:.: - -:-:::"::..::!:.;

<Рцг.2, Составитель Е. Федорова

Редактор Н. Швыдкая Техред M.Ìîðãåíòàë . Корректор И. Муска

Заказ 2664 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат Т1атент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101